В. Флюоресцентный микроскоп

Возникновение гистологии, цитологии и эмбриологии как самостоятельных наук. Основные положения клеточной теории на современном этапе развития науки. Развитие гистологии, цитологии и эмбриологии в Украине. Современный этап развития гистологии, цитологии и эмбриологии. Связь гистологии с другими науками медико-биологического профиля.

Основные принципы световой и электронной микроскопии. Виды микропрепаратов - срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф. Окраска и контрастности препаратов. Понятие о гистологических красителях.

1. Гистология. Определение, содержание и задачи современной гистологии. Ее разделы, значение для биологии и медицины.

Главные этапы цитологического и гистологического анализа:

- Качественный и количественный анализ полученных изображений

Количественные методы исследования - морфометрия, денситометрия, цитофотометрия, спектро-флуорометрия.

Микроскопические методы исследования имеют огромное значение для теории и практики медицины как способ изучения гистологических структур в норме, эксперименте и патологии.

Световой микроскоп. Микроскоп – оптический прибор, предназначенный для получения увеличенных изображений биологических объектов и деталей их строения, не видимых невооруженным глазом.

Микроскоп состоит из оптических и механических частей. Оптические части микроскопа: объективы, окуляры, зеркало и конденсор с ирисовой диафрагмой. Механические части микроскопа: основание, тубусодержатель, тубус, револьвер, предметный столик, механизмы макро- и микровинта, механизм перемещения конденсора

Объектив – основная оптическая часть микроскопа, которая создает изображение препарата. Объектив является системой линз в металлической оправе, где различают фронтальную – главную или увеличительную линзу, ближайшую к объекту, которая строит изображение и коррекционные – они устраняют аберрации фронтальной линзы. Объективы подразделяются:

А) по степени увеличения на объективы малых увеличений (увеличение ≤10), объективы средних увеличений (увеличение ≤40), объективы больших увеличений (увеличение ≥40),

Б) по степени совершенства исправлений аберраций (искажений) на монохроматы (предназначены для работы при монохроматическом освещении), ахроматы (хроматическая аберрация исправлена для 2 цветов спектра), апохроматы (хроматическая аберрация исправлена для 3 цветов спектра); планмонохроматы, планахроматы, планапохроматы (исправлена кривизна поверхности изображения),

В) по свойствам на суховоздушные и иммерсионные. При использовании суховоздушных объективов между препаратом и объективом воздушное пространство, при иммерсионыых между препаратом и объективом находится жидкость (иммерсионное масло, вода). Соответственно иммерсионные объективы делят на водные и маслянные. Получение максимального увеличения возможно только с помощью иммерсионного объектива (как правило, объектива с увеличением 90).Иммерсионные объективы рассчитываются на работу с покровными стеклами не толще 0,17 мм.

Окуляр – оптическая система, используемая для рассматривания изображения, построенного объективом. Простой окуляр (Гюйгенса) состоит из двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклой поверхностью в сторону объектива. Между линзами находится диафрагма с постоянным отверстием. К диафрагме крепится стрелка – указатель. Верхняя линза именуется глазной, на ее оправе указывается увеличение окуляра. Нижняя линза получила название полевой. Окуляр обычно увеличивает изображение в 5-25 раз

Зеркало – направляет поток света через конденсор на препарат. Имеет плоскую и вогнутую поверхности, которые используются в зависимости от степени освещения.

Конденсор – собирает лучи света и фокусирует их на препарат, обеспечивая достаточное и равномерное освещение последнего. Конденсор состоит из двух линз: нижней двояковыпуклой и верхней плосковыпуклой. С помощью конденсора регулируют степень освещения изучаемого объекта.

Механизм перемещения конденсора позволяет изменять его положение и тем самым увеличить или ослабить освещение препарата.

Ирисовая диафрагма, вмонтированная в конденсор, служит для изменения степени освещенности препарата.

Основание – используется для устойчивого положения микроскопа на столе.

Тубусодержатель – объединяет в единое целое все части микроскопа, т.к. последние прямо или косвенно соединяются с ним и для его транспортировки.

Предметный столик – служит для размещения препарата. В центре столика отверстие. Перемещение предметного столика в горизонтальной плоскости производится двумя центрировочными винтами, находящимися в основании столика.

Револьвер – состоит из двух (неподвижной и подвижной) дискообразных пластин. В последней укреплены объективы. Служит для быстрой смены объективов.

Тубус – полая металлическая трубка, в верхней части которой устанавливается окуляр, а к нижней крепится револьвер.

Макровинт – служит для грубой фокусировки резкости изображения.

Микровинт – необходим для тонкой наводки на резкость и для изучения препарата по толщине.

Важнейшими характеристиками микроскопа являются:

1) увеличение – способность раздвигать лучи, идущие от объектива. Оно определяется отношением линейных размеров изображения к линейным размерам объекта. Увеличение зависит от кривизны линзы - чем больше кривизна, тем больше увеличение. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличений объектива и окуляра. При этом надо помнить, что объектив увеличивает изучаемый объект, а окуляр – изображение, полученное при помощи объектива, не добавляя к нему новых деталей, не выявленных объективом.

2) качество изображения – характеризуется четкостью изображения и зависит от степени исправления основных оптических недостатков линзы – сферических и хроматических аберраций.

Сферические аберрации – более сильное преломление лучей, идущих через периферические зоны линзы по сравнению с прошедшими через ее центральные участки. В результате сферической аберрации изображение деталей объекта становится нечетким, расплывчатым. Уменьшить сферическую аберрацию можно путем подбора рассеивающих и собирательных линз различных по кривизне.

Хроматические аберрации – разложение лучей белого цвета на спектр, вследствие неодинакового преломления лучей с разной длиной волны. Для этого вида аберраций характерно искажение цвета и уменьшение четкости изображения. Исправление хроматической аберрации возможно при сочетании линз, изготовленных из разных видов оптического стекла, имеющих неодинаковые показатели преломления. Этот принцип используется при конструировании объективов микроскопа. В связи с этим различают ахроматические системы с меньшей степенью исправления хроматической аберрации и апохроматические, где последняя исправлена в большей мере.

Другие виды аберраций – кома, астигматизм, дисторсия имеют меньшее значение в практике микроскопирования,

3) разрешающая способность – характеризует способность линз давать раздельное изображение наиболее мелких деталей объекта. Предел разрешения – это наименьшее расстояние между двумя точками объекта, при котором они воспринимаются раздельно. Разрешающая способность для светового микроскопа приблизительно равна половине длины волны источника света и составляет приблизительно 0, 2 мкм.

Темнопольный микроскоп – применяется для изучения прозрачных, слабо преломляющих свет объектов, не видимых при освещении обычным способом. Для создания темнопольного освещения используются специальные конденсоры темного поля. Принцип освещения заключается в том, что лучи направляются на объект, не допуская попадания прямых лучей в объектив. Исследователь наблюдает светящиеся части изображения на темном фоне. Пределом возможностей такого способа микроскопирования является определение частиц до 2 нм. Существенный недостаток – невозможность определить форму и внутреннее строение наблюдаемых частиц.

Фазово – котрастный микроскоп – применяется для изучения малоконтрастных прозрачных (в частности, живых или неокрашенных) объектов, которые почти не поглощают света, т.е. не изменяют амплитуду световой волны, но изменяют фазу проходящей волны. Однако глаз не может регистрировать фазовых изменений. С помощью специального конденсора и объектива они искусственно превращаются в амплитудные, восприни-маемые глазом. В результате этого создается контрастное, четкое изображение неокрашенных структур.

Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количест-венного определения массы ткани, и дифференциальный интерферен-ционный микроскоп (с оптикой Номарского), который специально используется для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной и интерференционной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки.

Поляризационный микроскоп – выявляет в гистологических объектах изо- и анизоструктуры (одинарное и двойное лучепреломление в биологических объектах). Для получения поляризованного луча используют, в частности, призму Николя, помещаемую между источником света и объектом. Другая призма – анализатор находится во вращающейся обойме между объективом и окуляром. При повороте призмы анализатора на 90 градусов в поле зрения остаются видимыми только анизотропные структуры. Методом исключения определяются изотропные структуры, которые видны при нулевом положении призмы. Изображение препарата рассматривается через окуляр.

Ультрафиолетовый микроскоп – дает возможность уменьшить разрешаемое расстояние до 0,1 мкм вследствие применения ультрафиолетовых лучей. В качестве источника используют ртутно-кварцевые лампы. Вся оптика микроскопа, а также покровные и предметные стекла готовятся из кварца. В основе ультрафиолетовой микроскопии лежит избирательное поглощение биологическими тканями и клетками коротковолнового излучения, вследствие чего микроскопирование ультрафиолетовых изображений позволяет увидеть их структуру. Полученное в ультрафиолетовых лучах, не видимое глазом изображение, преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

Люминесцентный (флюоресцентный) микроскоп – используется для изучения распределения ряда химических компонентов в гистологических структурах. Основой для создания этого прибора послужило явление люминесценции, т.е. возбужденного свечения некоторых биологически важных соединений. Любая клетка живого организма обладает флюоресценцией, однако она обычно бывает чрезвычайно слабой. Наведенная (искусственная) люминесценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – люминофорами (акридиновый оранжевый). Их концентрация настолько мала, что они не влияют на состав и структуру препарата, а также не нарушают жизнедеятельность биологических объектов. Это дает возможность проводить витальные наблюдения. Соответственно основ преимуществом метода флюоресцентной микроскопии является возможность наблюдений цитологических объеков, в том числе и проведения на живом не фиксированном материале некоторых цито- и гистохимических реакций, причем в этом применении метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Электронный микроскоп -даетвозможность получить изображение объектов, величина которых в среднем имеет около 0,1-0,7 нм. Столь высокая разрешающая способность объясняется применением электронных лучей. Источником электронов является электронная лампа без оболочки. Вольфрамовая нить катода под влиянием нагрева излучает поток электронов, который направляется в тубус. В условиях вакуума электронные лучи в магнитном поле ведут себя подобно лучам видимого света в стеклянной призме. Поэтому электромагниты электронного микроскопа называют линзами. Различают конденсорную, объективную и проекционную линзы. Между конденсором и объективом помещают объект. Электронный пучок сначала фокусируется конденсорной магнитной линзой. Большая часть электронов, проходя через объект, фокусируется второй магнитной линзой – объективной, которая дает увеличенное изображение объекта. Это изображение увеличивается третьей магнитной линзой – проекционной. Электроны, которые проходят через объект, вызывают свечение экрана, покрытого люминофором, производя на нем изображение объекта, т.е.

изображение получается на люминесцирующем экране. Его фотографируют и, таким образом, предметом изучения является электронная микрофото-графия. С помощью электронного микроскопа стало возможным изучение ультраструктуры клеток и их производных, макромолекул, вирусов и др. субмикроскопических образований.

В настоящее время существуют два типа электронных микроскопов:

Так называемые растровые (сканирующие) электронные микроскопы позволяют получить объемное изображение изучаемых объектов. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т.е. последовательно «ощупывать» сфокусированным электронным лучом отдельные точки поверхности.

Главным достоинством растровой электронной микроскопии является большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения и высокая разрешающая способность.

Просвечивающий электронный микроскоп позволяет получить плоское изображение исследуемого объекта.

Микрометр - используется для измерения линейных размеров микроскопических объектов.

1. А.Д.Луцик, А.И.Иванова, К.С.Кабак, Ю.Б.Чайковский. Гистология человека.-К.: Книга-плюс, 2013. С.5-16.

1. Лабораторные занятия по курсу гистологии, цитологии и эмбриологии / Под. Ред.

2. Напханюк В.К., Сервецкий К.Л. Практикум по цитологии, общей гистологии и эмбриологии. Учебное пособие. Одесса, 1999. С. 8-23

3. Л.К.Жункейра, Ж.Кайнейро. Гистология. Уч. Пособие. Атлас. - М.:» ГЭОТАР-Медиа».

4. Гистология / Под ред. Ю.И.Афанасьева, Н.А.Юриной. М.: Медицина, 2006. С.10-16.

1. Для изучения прозрачных, слабо преломляющих свет объектов, не видимых при освещении обычным способом используют:

2. При исследовании мышечной ткани возникла необходимость выявить изо- и анизотропные структуры. Какой вид микроскопии для этого будет использован?

3. Основой для создания этого микроскопического прибора послужило явление люминесценции. Какой это прибор?

4. В эксперименте используются живые, не окрашенные объекты, содержащие структуры, по разному преломляющие световые лучи. Какой вид микроскопии необходимо использовать в данном случае?

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: