Краткий курс по общей микробиологии, иммунологии, санитарной и частной микробиологии

КРАТКИЙ КУРС

общей микробиологии, иммунологии, санитарной и частной микробиологии

к практическим занятиям для студентов лечебного, медико-профилактического, стоматологического, фармацевтического факультетов и факультета высшего сестринскою образования

Рязань 2003

УДК 576.8

Составители: доцент В.И. Коноплева, доцент О.В. Евдокимова,

ст. преподаватель К.А. Силин, асс. В.В. Царьков

Под редакцией ст. преподавателя кафедры микробиологии К.А. Силина

Рецензенты: зав. кафедрой инфекционных болезней РязГМУ проф. Е.Р.Корвякова,

зав. кафедрой общей гигиены с курсом экологии РязГМУ проф. А.А. Ляпкало

Краткий курс по общей микробиологии, иммунологии, санитарной и частной микробиологии

к практическим занятиям для студентов лечебного, медико-профилактического, сто­матологического, фармацевтического факультетов ифакультета высшего сестрин­ского образования; В.И. Коноплева, О.В. Евдокимова, К.А. Силин, В.В. Царьков. - Ря­зань, РГМУ. - 2003. - 80 с.

© Составители, 2003

© Рязанский государственный

Медицинский университет, 2003

ВВЕДЕНИЕ

ПОНЯТИЕ О МИКРОБАХ

Объектом изучения микробиологии являются микроорганизмы (микробы) - мельчайшие не­видимые одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или растительного царства.

Особенности микробов:

- малые размеры (обычно их измеряют в микрометрах, 10^{-6 м, мкм);}

- слабая морфологическая дифференцировка (относительно простое строение);

- быстрый рост и размножение (в благоприятных условиях одна особь за сутки может дать потомство в сотни миллионов особей);

- высокая активность обменных процессов (быстрый синтез и разложение веществ,
получение энергии);

- повсеместное распространение (связано с выраженной способностью к адаптации).

Микробиология является комплексом наук. В зависимости от объекта исследования различа­ют: бактериологию, вирусологию, микологию (объект - грибы), протозоологию (объект - простей­шие). По целям изучения микробиология делится на общую, медицинскую, санитарную, ветери­нарную, промышленную, космическую и др.

Задачи медицинской микробиологии:

1. Изучение биологии патогенных (болезнетворных) и нормальных для человека микробов.

2. Изучение роли микробов в возникновении, развитии инфекционных (заразных) болезней и формировании иммунного ответа макроорганизма ("хозяина").

3. Разработка методов микробиологической диагностики (распознавания), специфического
лечения и профилактики (предупреждения) инфекционных болезней человека.

Микробиологические исследования проводятся в специальных научных или практических лабораториях, где поддерживается противоэпидемический режим. Соблюдение особых правил ра­боты в лаборатории преследует 2 цели: а) исключить возможность внутри лабораторного заражения и выноса инфекции за пределы лаборатории; б) предотвратить микробное загрязнение воздуха, оборудования и материалов, снижающее качество анализа.

КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Микробы, как наиболее древняя форма жизни, в системе организмов представлены довольно широко. Они входят (наряду с другими организмами) в надцарство эукариотов, полностью составляют надцарство прокариотов и царство вирусов.

Прокариоты - это, как правило, одноклеточные организмы, бактерии, отличающиеся слабой морфологической дифференцировкой (доядерные); для них характерно:

- отсутствие окруженного мембраной ядра (носителем наследственности является нуклеоид - замкнутая в кольцо нить ДНК, единственная "бактериальная хромосома");

- отсутствие органелл (митохондрий, хлоропластов, комплекса Гольджи и др.);

- размножение бинарным амитотическим делением (надвое);

- особое строение и состав клеточной стенки, малые размеры рибосом, своеобразные фермен­ты белкового синтеза.

Прокариоты разделены на 35 групп: спирохеты, несколько групп собственно бактерий (на­пример, "грамположительные кокки", "спорообразующие грамположительные палочки и кокки", "грамотрицательные аэробные палочки и кокки" и др.), а также риккетсии и хламидии, микобактерии, микоплазмы. В основе деления прокариот на группы лежат: форма и строение клетки, отношение к окраске методом Грама, тип метаболизма и другие признаки. Внутри группы выделены более мелкие таксоны: порядок, семейство, род, вид (основной таксон). Название вида микроба, как правило, состоит из родового и видового названий. Например, один из возбудителей дизентерии носит название- Shigella sonnei.

Микроскопические эукариоты - это относительно более высоко организованные однокле­точные и многоклеточные организмы, имеющие сходство с клетками животных (простейшие) и растений (грибы). Для эукариот характерны:

- наличие истинного ядра, в котором находится набор линейных хромосом, распределяющих­ся в ходе митоза в дочерние клетки;

- различные органеллы (митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулум и др.);

- рибосомы большего размера, чем у прокариот;

- способность к эндоцитозу (захвату частиц и растворенных веществ).

Вирусы - это мельчайшие неклеточные организмы, которые можно противопоставить всем другим существам. Основные свойства вирусов:

- отсутствие клеточного строения;

- отсутствие собственных метаболических систем (у вирусных частиц - вирионов нет обмена с внешней средой);

- облигатный внутриклеточный паразитизм;

- наследственный материал (геном) представлен одним типом нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ

Приготовление препарата для микроскопического исследования

Окраска по Граму.

1 этап - приготовление мазка.

Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокален­ной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тща­тельно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных куль­тур готовят без предварительного нанесения ИХН.

2 этап - высушивание.

Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.

3 этап - фиксация.

Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накла­дывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифоро­ва). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.

4 этап - окраска.

Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы по­зволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные спо­собы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красите­лям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристаллвиолетом (3-5 минут), а сложных - окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.

Стерилизация

Стерилизация - полное обеспложивание объектов, при котором уничтожаются все формы микроорганизмов (вегетативные и споры). Для стерилизации применяют физические и химические методы. Выбор метода определяется видом стерилизующего материала, который после стерилиза­ции должен сохранять свои основные свойства (форму, эластичность, активность и др.). Физиче­ские методы - действие высокой температуры, ионизирующего излучения, фильтрование через коллоидные фильтры.

Дезинфекция

Дезинфекция - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение в объектах конкретных патогенных микробов. После дезинфекции могут сохраняться непатогенные микробы. В медицине применяют физические и химические методы дезинфекции.

1. Физические методы: 1) механические (вытряхивание, проветривание, влажная уборка, стирка с мылом); 2) действие высокой температуры (прокаливание утюгом, кипячение, пастериза­ция); 3) УФО (облучение бактерицидными лампами).

2. Химические методы - применяют в различных концентрациях следующие дезинфицирую­щие вещества: I) хлорсодержащие препараты (хлорная известь, хлорамин Б, гипохлорит кальция, хлоргексидин и др.); 2) окислители (перекись водорода, перманганат калия); 3) фенолы (карболо­вая кислота, лизол); 4) йод и йодофоры (йод + ПАВ); 5) соли тяжёлых металлов (сулема, диоцид, мертиолят); ПАВ (сульфанол); 7) четвертичные аммонийные соединения (роккал); 8) 70% эта­нол; 9) формалин; 10) красители (бриллиантовый, зеленый); II) кислоты (салициловая, борная и др.).

Механизм дезинфекции различен: механическое удаление; коагуляция белков при нагрева­нии; хлорсодержащие препараты и формалин взаимодействуют с аминогруппами белков, окисли­тели - с сульфгидрильными группами; фенолы повреждает клеточную стенку и нарушают процес­сы дыхания, соли тяжелых металлов образуют альбуминаты белков, ПАВ изменяют заряд клеточных мембран, четвертичные аммонийные соединения нарушают процессы дыхания, краси­тели взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и т.д.

Асептика - система профилактических мероприятий, направленных на предотвращение по­падания в рану, лекарственные препараты микроорганизмов. Она включает: I) стерилизацию инст­рументов, приборов, материалов; 2) специальную обработку рук перед асептичной работой; соблюдение определенных правил и приёмов работы (стерильный халат, маска, перчатки, исключение разговоров и т.п.); 4) осуществление специальных санитарно-противоэпидеческих и гигиенических мероприятии (правильная вентиляция, влажная уборка с применением дезинфицирующих средств, облучение бактерицидными лампами).

Антисептика - комплекс мероприятий, направленных на уничтожение микробов, попавших в рану, лекарственный препарат или другой объект. Применяют антисептику: I) механическую, например, удаление из раны инфицированных или нежизнеспособных тканей при обработке раны; 2) физическую (наложение гигроскопических повязок, применение гипертонических растворов, способствующих оттоку раневого, отделяемого в повязку, сухого тепла, УФС. лазера и т.д. 3) химическую (применяют химические вещества, обладающие бактерицидными или бактериостатическим действием при минимальном органотропном действии, например хлоргексидин; в лекарственные препараты вносят борную кислоту, мертиолят и др.); 4) биологическую (применение анти­биотиков, бактериофагов, иммуноглобулинов, средств, стимулирующих защитные силы организ­ма).

Пастеризация - однократное кратковременное прогревание при температуре ниже 80°С, частичное обеспложивание продуктов только от болезнетворных бактерий. Как и кипячение, пастеризация не является методом стерилизации. После пастеризации сохраняются споры и вегетативные формы, поэтому пастеризованный продукт (молоко, соки и т.д.) хранят в холодильнике.

ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ

Ферменты микробов

В микробной клетке ферменты катализируют многочисленные процессы биосинтеза клеточ­ных структур и получения энергии. У бактерий обнаруживаются основные группы ферментов: гидролаза, оксидоредуктазы, трансферазы, липазы, лигазы, изомеразы. Часть из них (экзоферменты) выделяется наружу, осуществляя внеклеточные реакции: расщепление макромолекул пита­тельных веществ до простых соединений, разрушение антибиотиков (например, бета-лактамаза инактивирует пенициллин) и др. Эндоферменты катализируют реакции внутри клетки: располо­женные в цитоплазматической мембране пермеазы переносят питательные вещества в клетку, оксидоредуктазы обеспечивают получение энергии и т.д. Кроме того, болезнетворные бактерии мо­гут обладать ферментами, выполняющими функцию факторов патогенности. Например, гиалуронидаза расщепляет основное вещество соединительной ткани, фибринолизин участвует в растворении кровяных сгустков, что способствует распространению возбудителя в организме.

Ферменты обладают высокой специфичностью и многообразием у микробов. По индивидуальному набору ферментов (биохимическим свойствам) часто определяют вид микроба. Наибольшее значение при идентификации бактерий имеет определение сахаролитических и потеолитических свойств. При этом изучаемый микроорганизм помещают в питательную среду, содержащую субстрат (углевод или белок) и индикатор. О наличии фермента судят по изменению цвета индикатора, который реагирует на продукты разложения субстрата.

Микробные ферменты широко используют в биотехнологии и медицине. С их помощью осу­ществляют генноинженерные исследования, получают биологически активные вещества, вакцины, сыворотки. В медицине, например, для улучшения пищеварения применяют амилазу и диастазу из аспергиллов, для заживления ран (ожогов) - коллагеназу из клостридий.

ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Микроорганизмы послужили удобной моделью для генетических исследований приведших к важнейшим открытиям 21 века в биологии: показано, что материальным носителем (основой)наследственности являются нуклеиновые кислоты - ДНК и РНК; установлено детальное строение хромосомы; расшифрованы механизмы генетического обмена и его регуляции, достижения генетики микроорганизмов послужили основой для становления и развития новой перспективной отрасли - биотехнологии. Она призвана использовать свойства микробов и клеточныхкультур, биологических процессов в производстве: биологически-активных веществ (антибиотиков, гормонов, белков, аминокислот), энергоносителей, полезных новых видов микробов, сортов растений, видов животных, эффективных вакцин, а также в борьбе с загрязнением окружающей среды и болезнями растений.

Микробы как объекты генетических исследований, обладают рядом преимуществ: бактерии содержат гаплоидный набор генов, поэтому изменения их генотипа с неизбежностью влекут за со­бой изменение фенотипа; для них характерно быстрое размножение и огромная численность по­томства (быстрая смена поколений); работа с микробами не требует больших затрат.

БАКТЕРИОФАГИ

БАКТЕРИОФАГИ - вирусы бактерий, которые обладают способностью лизировать бактери­альную клетку или изменять ее свойства. Фаги размножаются в клетках чувствительных к ним бактерий.

Строение фага кишечной палочки (Т₂)

Средние размеры фагов - 25-110 нм.

По характеру взаимодействия с чувствительной клеткой фаги различают:

а) вирулентные (дают литическую продуктивную инфекцию);

б) умеренные (вызывают лизогенизацию клетки).
По специфичности различают:

а) полифаги (лизируют несколько видов бактерий);

б) монофаги (лизируют только один вид бактерий);

в) типовые фаги (лизируют не все штаммы данного вида, а лишь некоторые, принадлежащие к одому фаговару).

Этапы взаимодействия вирулентного фага с клеткой:

1. Адсорбция фага на специфических рецепторах клеточной стенки (с участием фибрилл и отростка).

2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага внутрь бактериальной клетки (лизоцим отрост­ка фага растворяет клеточную стенку бактерии в месте адсорбции, чехол сокращается, стержень проходит сквозь клеточную стенку и нуклеиновая кислота фага поступает внутрь бактериальной клетки, оболочка головки остается снаружи).

3. Синтез в клетке компонентов фага (проникшая нуклеиновая кислота фага вызывает пол­ную перестройку метаболизма клетки; на рибосомах синтезируются белки фага, а в других участ­ках клетки реплицируется его нуклеиновая кислота).

4. Сборка фаговых частиц и лизис клетки (нуклеиновая кислота наполняет белковые головки пристраивается отросток; лизоцим фага растворяет клеточную стенку бактерии, клетка лизируется, и из нее выходят 100-300 новых фагов; они внедряются в соседние клетки и также лизируют их; в результате мутная культура бактерий на жидкой среде просвегляется, а на плотной среде образует­ся колония фага - "стерильное пятно").

Титрование фагов

Активность препарата фага определяется его титром. Титр фага - наибольшее его разведение, еще вызывающее лизис чувствительной культуры бактерий.

Фаги титруют следующими методами.

/. Титрование фага на жидкой среде

Готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого фага в жидкой питатель­ной среде; 10^-1, 10^-2, 10^-3, и т.д. В эти разведения вносят чувствительную культуру бактерий. Про­бирки инкубируют в термостате при 37°С 18-20 часов. Затем отмечают наибольшее разведение фа­га, ещё вызывающее лизис внесённой культуры (рост бактерий в этой пробирке отсутствует). Это разведение, и является титром фага. Например: "титр фага - 10^-6"

2. Титрование фага на плотной среде

Чашку с плотной средой делят на несколько зон. Культуру чувствительных бактерий высева­ют сплошным газоном на поверхность среды. Затем в соответствующие зоны наносят по капле различных десятикратных разведений фага. После инкубации в термостате при 37°С 18-20 часов отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис (образование "стерильного пят­на").

ИНФЕКЦИЯ

Различают несколько форм взаимодействия (симбиоза) двух биологических видов, в том чис­ле паразитизм, когда один живёт за счет другого, нанося ему вред (+-). Паразит, как правило, за­висит от хозяина. Частным случаем паразитизма является инфекция.

Инфекция (инфекционный процесс) - это закономерно развивающийся процесс взаимодей­ствия микроба и восприимчивого макроорганизма, сопровождающийся физиологическими и пато­логическими реакциями, нарушением гомеостаза и функций организма.

Инфекционная болезнь - крайняя (по выраженности) форма инфекции.

ИММУНИТЕТ

Виды и формы иммунитета

Различают, иммунитет тканевой (обусловливает несовместимость тканей) и антиинфекцион­ный (противомикробный и противопаразитарный).

Антиинфекционный иммунитет включает: естественную резистентность (неспецифическая защита) и приобретённый иммунитет (специфическая защита).

Естественная резистентность представлена:

а) видовой невосприимчивостью (невосприимчивость к микробам, патогенным для других
видов),

б) невосприимчивостью при генетических отклонениях от нормы (например, люди с серповидной формой эритроцитов не болеют малярией),

в) собственно естественной резистентностью.

Приобретенный иммунитет имеет следующие формы:

1)активный (в его создании принимает участие собственная иммунная система), в том числе:

а) постинфекционный (после перенесённого заболевания),

б) поствакцинальный (после введения вакцинного препарата),

2) пассивный (когда в организм вводятся готовые специфические антитела или иммуноциты),
в том числе:

а) плацентарный (передаваемые от матери через плаценту плоду антитела),

б) постсывороточный (после введения иммунной сыворотки).

Формы 1а и 2а являются естественным иммунитетом, формы 16 и 26 - искусственным. По на­правленности приобретенный иммунитет (формы I а,б и 2а,б) может быть антитоксическим (защита от чужеродного яда) и антимикробным (невосприимчивость к микробам). В свою очередь анти­микробный иммунитет (по присутствию или отсутствию в организме живых микробов) делят на нестерильный (инфекционный) и стерильный.

Особым видом защиты является местный иммунитет, которому свойственны черты и естест­венной резистентности и приобретенного иммунитета.

Признаки естественной резистентности:

1. Наследуется, являясь видовым признаком.

2. Отличается относительной стойкостью в течение жизни.

3. Формирование не связано с поступлением антигена (чужеродных агентов).

4. Механизм защиты однотипен вне зависимости от вида возбудителя (неспецифичность защиты)

Признаки приобретенного иммунитета:

1. Приобретается в течение жизни индивидуума (не наследуется).

2. Нестоек во времени.

3. Строго специфичен (направлен против того возбудителя или яда, к которому иммунизиро­ван индивидуум).

РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА

Реакциями иммунитета (серологическими реакциями) называют действие между анти­генами и антителами, ведущее к образованию иммунного комплекса (антиген-антитело). Они про­текают, как правило, в 2 фазы в присутствии дополнительного фактора (электролит, комплемент, фагоцит или др.). Специфическая фаза (невидимая, "химическая") происходит очень быстро и ха­рактеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела, В ре­зультате образуется комплекс, утрачивающий растворимость в изотонических растворах например, в растворе хлорида натрия. Неспецифическая фаза (видимая, "коллоидная") наступает через не­сколько минут или часов и характеризуется укрупнением комплекса антиген+антитело с изменением его физических свойств. Эта фаза сопровождается видимыми феноменами: выпадением осад­ка, образованием хлопьев, просветлением взвеси, остановкой движения частиц и др.

Реакции иммунитета высокоспецифичны и их широко применяют на практике для серодиаг­ностики инфекций (по обнаружению антимикробных антител в сыворотке крови), определения ви­да и варианта микроба по антигенной структуре, определения других антигенов (аллергенов, гор­монов, биологических образцов разного происхождения). Области применения реакций иммунитета: диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний, фармация, санитарно-ветеринарная служба, трансплантация органов и тканей (в т.ч. крови), судебная медицина.

Реакция агглютинации (РА) - это взаимодействие корпускулярного антигена (взвеси бакте­рий, других клеток или частиц) и антител - агглютинов в изотоническом растворе с образованием и осаждением агглютината (хлопьев из склеившихся частиц).

Реакцию ставят несколькими методами. Быстрая ориентировочная РА ставится на предмет­ном стекле и учитывается в течение 2-3 мин после смешивания ингредиентов и покачивания стек­ла. Более надежные результаты даёт использование адсорбированных и монорецепторных сыворо­ток, что позволяет избежать неспецифических реакций, например, с родственными бактериями за счет общих антигенов. Развернутая (объёмная) РА более точна, она ставится в пробирках и учиты­вается через сутки. В ряду пробирок готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в ИХН - 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. Затем в каждую пробирку добавляют одинаковое количест­во взвеси клеток, встряхивают и ставят при комнатной температуре. Результат учитывают по ха­рактеру осадка и просветлению надосадочной жидкости. Титром агглютинирующей сыворотки считают её максимальнее разведение, при котором наблюдается выраженная реакция. РА используют для идентификации микробов по антигенной структуре, для определения антимикроб­ных антител и их титра в сыворотке при серодиагностике инфекционных заболеваний, при опреде­лении группы крови и т.п.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) является разновидностью не­прямых агглютинационных реакций, наряду с реакцией коагглютинации, агглютинации латекса и др. Эти реакции более чувствительны, чем РА, т.к. предварительно стандартный антиген (или ан­титело) присоединяют к корпускулярному носителю - эритроцитам, убитым микробам или части­цам латекса, получая, соответственно, эритроцитарные, коагглютинирующие или латексные диагносгикумы (антигенные или иммуноглобулиновые). РПГА с антигенным эритроцитарным диагностгкумом ставят в пробирках или лунках планшета с двукратными разведениями сыворотки (например, с целью серодиагностики инфекций или выявления напряжённости иммунитета - по титру антител). При положительной реакции через 4-20 ч формируется рыхлый осадок эритроци­тов на всей площади дна пробирки или лунки - «зонтик». При отрицательной реакции эритроциты образуют плотный осадок в центре (в виде «пуговки»). РПГА с иммуноглобулиновыми диагности-кумами учитывают так же, но её ставят для быстрой индикаций возбудителя в исследуемом мате­риале или его идентификации по антигенной структуре. Это метод экспресс-диагностики.

Реакция преципитации (РП) - это выпадение в осадок растворимого антигена при взаимо­действии с сответствующими антителами-преципитинами в присутствии электролита. Антигеном может быть прозрачный раствор белка или гаптена, различные экстракты.

РП ставят несколькими методами. Метод кольцепреципитации: на диагностическую сыворот­ку с известными преципитинами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают раствор антигена и в течение часа учитывают положительную реакцию (на границе жидкостей образуется белый диск преципитата и постепенно оседает). Так определяют, например, антиген возбудителя сибир­ской язвы в разных материалах. Метод преципитации в капилляре: стеклянный капилляр диамет­ром I мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыворотку, а затем на 1/3 - в раствор антиге­на, переворачивают несколько раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зёрна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в капилляре. Так оп­ределяют, например, С-реактивный белок (СРБ) при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, ту­беркулёзе, инфаркте миокарда (диагностическую сыворотку с преципитинами к СРВ получают пу­тем иммунизации кроликов). Методы диффузной преципитации в агаровом геле: растворы антигенов и антител помещают в разные места прозрачного геля, из которых они диффундируют, образуя при встрече преципитат в виде белых полос или линий. В методе простой диффузии анти­ген диффундирует в агаре, содержащем определенную концентрацию диагностической сыворотки, которую предварительно вводили в не застывший агар. В методе двойной диффузии антигены и антитела из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара.

В методе иммуноэлектрофореза раствор неоднородного антигена сначала подвергают фрак­ционированию в агаровом геле под действием постоянного тока а затем канавку в теле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сывороткой (антителами). В результате двой­ной диффузии в геле образуется специфический рисунок из дуг к линий преципитата, вид которого зависит от количества и качества фракций антигена и антител.

РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявлять белковые антигены в раз­ведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступных для обнаружения химическим путём. Титром преципитирующей сыворотки считают наибольшее разведение антигена, дающее преципитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием антигена, малы­ми размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных антигенов в материале от больных и из внешней среды, определения иммуноглобулинов разных классов (диагностика и профилактика инфекций и иммунодефицитов) для выявления фальсификации пищевых продуктов (санитарная практика), для определения видовой принадлежности крови и других биологических примесей (судебно-медицинская практика).

Реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН) - серологическая реакция между мик­робным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Её ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для опре­деления титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известной диагностической сывороткой (в избытке), выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают (как и в контрольной группе жи­вотных, получивших тот же материал без сыворотки). В обычной лабораторной практике данную реакцию используют для диагностики ботулизма. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сыворот­кой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее оп­ределенное число минимальных летальных доз-DLM токсина (это количество соответствует I ан­титоксической единице, АЕ сыворотки). Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME (международных антитоксических единиц) в I мл сыворотки. Например, I ME противодифтерий­ной сыворотки нейтрализует 100 DLM дифтерийного токсина для морской свинки.

Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках - в реакции флоккуляции (разновидность РП). Оно основано на том, что при смешивании экзотоксина или анатоксина (т.е. белкового антигена) с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение (инициальная флокку-ляция) наблюдается в пробирке с эквивалентным соотношением токсина (анатоксина) и антиток­сина (т.е. I TE (Lf): I АЕ (МЕ)).

Реакция иммунофлюоресценции (ИФ) - взаимодействие люминесцирующих антител с кор­пускулярным антигеном и образование светящегося иммунного комплекса. Метод основан на спо­собности иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами (ФИТЦ, акридиновым оран­жевым и др.) без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию.

В прямом методе ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок из антигенсодержащего материала, наносят на него люминесцирующую сыворотку (например, противочумные анти­тела, меченные ФИТЦ). После 30-минутного контакта препарат тщательно промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материале светятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в I фазу и обладает рядом достоинств: высо­кочувствительна, проста в постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики (ответ в течение 1-2 ч). Её используют для быстрого обнаружения микробов в исследуемом материа­ле, а также для их идентификации.

Непрямой метод ИФ отличается тем, что на стекло наносят обычные кроличьи антитела, ко­торые образуют с клетками невидимый комплекс АГ+АТ. Затем препарат промывают и обрабаты­вают люминесцирующей: сывороткой с ослиными (лошадиными) AT к кроличьему белку (образу­ется двойной светящийся комплекс). Этот метод более экономичен, т.к. используется одна люминесцирующая и набор нелюминесцирующих сывороток.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Основан на использовании антител, меченных фермен­том, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИФА широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале (сэндвич-метод) вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистиро­ловой пластины, затем вносят антигенсодержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела (сыворотку), меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат (5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др.).

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интен­сивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител (например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции) на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом,и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учиты­вают так же. ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

ИММУНОБЛОТТИНГ

Качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе.

Для выявления антител:

Исследуемую сыворотку больного инкубируют с известными антигенами нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану, затем добавляют меченную диагностическую сыворотку против иммуноглобулинов человека.

Для выявления антигена:

С помощью электрофореза разделяют белки в исследуемой пробе от больного, затем их пере­носят на нитроцеллюлозную мембрану и добавляют меченную диагностическую сыворотку против известных антигенов

Иммуноблоттинг широко применяется для подтверждения твердофазного иммуноферментного анализа.

Классификация вакцин

В настоящее время для профилактики инфекционных заболеваний применяют следующие вакцинные препараты:

1) Вакцины живые составляют примерно половину из всех применяемых в практике вакцин. Живые вакцины при введении в организм (обычно в дозе 1 тыс.-1 млн. клеток) приживаются, раз­множаются, вызывают вакцинальный процесс и формирование активного иммунитета против со­ответствующего возбудителя. Вакцины получают из аттенуированных вакцинных штаммов или из непатогенных для человека природных (дивергентных) штаммов, имеющих общие антигенные свойства с болезнетворными патогенными штаммами представляют собой взвеси выращенных на различных питательных субстратах вакцинных штаммов. Основным свойством живого аттенуированного штамма, используемого в производстве вакцин, является стойкая утрата вирулентности при сохранении способности вызывать иммунную реакцию, схожую с естественной. Вакцинный штамм размножается в организме хозяина и индуцирует клеточный, гуморальный, секреторный иммунитет, создавая защиту всех входных ворот инфекции. Главными преимуществами живых вакцин являются:

— высокая напряженность, прочность и длительность создаваемого ими иммунитета;

— возможность применения не только путем подкожного введения, но и другими, более про­стыми путями (накожно, перорально, интраназально).

Живые вакцины имеют ряд недостатков:

— сложно комбинируются и плохо дозируются;

— категорически противопоказаны людям, страдающим иммунодефицитом;

— вызывают вакцинно-ассоциированные заболевания

— относительно нестабильны;

— естественно циркулирующий дикий вирус может тормозить репликацию вакцинного виру­са и снизить эффективность вакцины; это отмечалось в отношении вакцинных штаммов полиовируса, размножение которого может подавляться при инфицировании другими энтеровирусами.

В процессе производства, транспортировки, хранения и применения живых вакцин, на­ходимо строго соблюдать меры, предохраняющие микроорганизмы от гибели и гарантирующие сохранение активности препаратов (холодовая цепь).

В Российской Федерации живые вакцины широко применяют с целью специфической профи­лактики полиомиелита, кори, эпидемического паротита, гриппа, туберкулеза, чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы.

2) Убитые вакцины (инактивированные) получают путем получаемые путем инактивации выращенны<

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: