Изготовление срезов растений и подготовка предметных и покровных стёкол

Анатомические исследования подразумевают, прежде всего, подготовку объектов изучения таким образом, чтобы его можно рассматривать в микроскоп. Наиболее широко распространенным типом микроскопа, особенно на уровне студенческих исследований, является световой, а значит, объект должен пропустить через себя пучок света.

Из растительных объектов готовят тонкие срезы, толщиной 8 - 25 мкм. Изначально готовили срезы опасной бритвой от руки. Объект зажимают между кусочками сердцевины бузины (сейчас используют пенопласт, сердцевину топинамбура). Это очень трудоемкий способ, требующий отработанных навыков. Безусловно, таким способом, работая безопасной бритвой, нельзя подготовить массовый материал, серийные срезы, срезы значительной площади.

Совершенно изменилась технология работы с изобретением микротома. Эволюция этого аппарата прошла очень быстро по пути совершенствования. Наиболее трудной задачей является механизм закрепления объекта, из которого необходимо изготовить срезы. Если древесина как твердый материал может быть укреплена зажимами, то мелкие объекты (семена), мягкие (лист, кора) не могут быть закреплены таким образом. Есть методы специальной обработки материала (заливка в целлоидин, парафин), но они трудоемки и требуют значительного времени. Чтобы выполнить ВКР с использованием этих методов, надо работать с материалом не менее 3-х лет. Огромным прогрессом стало изобретение замораживающих столиков. Объект к ним прикрепляется с использованием низких температур.

Эти столики могут работать с использованием углекислоты, что более приемлемо для мягких животных тканей, особенно в медицине. В ботанике наиболее удобным являются столики, работающие по типу «холодильника». Постоянный ток проходит через термопару, тепло удаляется проточной водой.

Из зафиксированного материала готовят микрообъекты в виде кубиков или призм. Площадь поперечного среза зависит от характера материала. Если он однородный, то может быть больше, а если его структура гетерогенна (на границе коры и древесины), то не более 0,5 × 0,5 см; для продольных срезов (радиальный, тангентальный) один из размеров (по направлению оси органа) желательно делать длиннее (до 0,7 - 0,8 см). Приготовленный таким образом материал выдерживают в воде не менее 0,5 часа (лучше дольше), меняя через 10 - 15 минут воду. Таким образом, спирт удаляют из объекта и он хорошо примораживается. Древесину перед изготовлением микрообразцов следует варить в смеси воды и глицерина (1:1) в огнеупорной колбе на электрической плитке в течение 5 - 6 часов. Вода испаряется и ее следует периодически доливать, но ни в коем случае не в кипящую массу, а только после некоторого охлаждения с соблюдением осторожности. В противном случае происходит выброс горячей массы, который может привести к повреждению лица и рук. После такой подготовки древесина становится очень эластичной, и длина поперечного среза может достигать 2 см.

Подготовленные микрообъекты ориентируют на замораживающем столике соответствующим образом, включают вначале воду и спустя 3 - 4 минуты выпрямитель переменного тока в постоянный и наносят на объект по каплям пипеткой воду до тех пор, пока весь объект не будет покрыт небольшим куполом льда. Со стороны, противоположной движению ножа, намораживается большая площадь льда, т.к. надо обеспечить упор давлению ножа.

При резке растительных объектов необходимо помнить, что в любом органе присутствуют как мягкие не одревесневшие ткани, так и механические, сильно лигнифицированные. Поэтому очень важно «найти» правильный угол наклона ножа, угол между лезвием ножа и направлением его движения.

Толщину среза или устанавливают фиксированную, в этом случае доведение ножа назад до упора обеспечивает поднятие столика на толщину среза, или устанавливают вручную, поднимая после каждого среза замораживающий столик.

Разнообразие растений обуславливает и разнообразие подходов в процессе резки. Очень хорошо режутся лимонник, липа, бузина, очень трудно объекты с твердой древесиной, поэтому каждый новый объект требует некоторого испытания разных приёмов.

Одним плавным, без рывков, движением ножа на себя производят срез, кисточку (желательно беличью) каждый раз смачивают в воде, движением по ножу на себя снимают срез и помещают его в бюксу с водой (ни в коем случае не спиртом, т.к. кисточка, смоченная спиртом, будет переносить его на объект, и приведет к разрушению блока).

Изготовление срезов на микротоме позволяет получить их значительное количество, а значит, позволяет вести отбор для изготовления препаратов. Необходимо готовить срезы разной толщины. Сделать очень тонкий срез, пригодный для фотографирования, но большой площади, невозможно. Срезы большой площади дают возможность судить о соотношении тканей, их топографии.

Если полученные срезы сразу не будут использованы для изготовления препаратов, то в воду следует добавить спирт, и препараты можно сделать на второй день.

Из полученных срезов готовят временные и постоянные препараты, но этому предшествует подготовка предметных и покровных стекол. Основные требования к ним: стекла должны быть обезжирены, что достигается тщательной промывкой. Стекла моют в горячей воде с мылом, протирая с обеих сторон щеточкой. Затем помещают в емкости с наструганным мылом и кипятят в течение часа, осторожно переворачивая их. Не рекомендуется использование специальных порошков, т.к. они оставляют на поверхности налет.

После кипячения стекла тщательно промывают в холодной воде под краном и погружают в насыщенный водный раствор двухромовокислого калия с крепкой серной кислотой в пропорции 3:1 или 4:1 (хромпик). В этой смеси стекла хранят не менее суток, используя по мере необходимости. Перед изготовлением препаратов стекла хорошо промывают от хромпика.

Можно промытые в мыльной воде стекла поместить на несколько часов в 10-15% раствор калийной щелочи, затем промыть водой и перенести в слабый 1-5% раствор соляной кислоты и через 1-2 минуты снова промыть водой.

Предметные стекла, на которые помещают препараты, должны быть хорошо обезжирены и промыты. На правильно подготовленных стёклах нанесенные капли воды хорошо растекаются. Если же на стекле остались следы жира, то вода собирается каплями, не растекаясь. На такие стекла срезы накладывать не следует, так как они не закрепляются на нем.

Для первоначального знакомства с полученными срезами, а иногда и для наблюдения, готовить постоянные препараты нецелесообразно. В этом случае ограничиваются временными препаратами, которые хранят непродолжительное время. Средой, в которую помещают срез, является вода, если материал свежий, т.е. живой. Если материал зафиксирован, то для этой цели используют глицерин (чистый или разбавленный водой) или другие просветляющие жидкости.

Срезы помещают в чистый или слегка разбавленный глицерин, в котором они могут находиться до нескольких месяцев. Для более длительного хранения покровное стекло обводят жидким парафином или канадским бальзамом, чем достигается прикрепление покровного стекла к предметному.

4.7.2 Окраска срезов и приготовление постоянных препаратов

Если срезов несколько, то их окрашивают на предметом стекле. Но при изготовлении срезов на микротоме их готовят несколько десятков, что делает возможным выбор, тогда срезы окрашивают в небольших бюксах. В этом случае срезы помешивают очень осторожно кисточкой, чтобы предотвратить слипание и обеспечить равномерное окрашивание.

Для окрашивания срезов из вегетативных органов растений используют чаще всего сафранин и водный или нильский синий. Вообще, красителей много, их применение обусловлено характером и природой объекта.

Итак, в бюксы, где в воде находятся срезы, добавляют сафранин. В сафранине срезы следует выдерживать не менее 30 минут. Затем, осторожно сливая и добавляя воду, промывают срезы для удаления сафранина. На приготовленное предметное стекло наносят пипеткой несколько капель воды и препаровальными иглами или кисточкой извлекают из стаканчиков (лучше их перелить в чашку Петри) окрашенные сафранином срезы и кладут на предметное стекло. Срезы подбирают по величине, как по всей площади объекта, так и более мелкие кусочки, которые, как правило, тоньше. На срезах большей площади устанавливают расположение и соотношение тканей, а тонкие срезы более пригодны для микрофотографирования.

Заранее готовят полоски фильтровальной бумаги по площади в 2 раза превышающие ширину предметного стекла и чуть больше по длине. Берут несколько полосок и, постепенно прижимая их к стеклу по направлению к себе, убирают воду, при этом после полного контакта со стеклом пальцами с нажимом разглаживают бумагу, это обеспечивает хорошее отхождение срезов от фильтровальной бумаги. Подняв бумагу, отбрасывают 2-3 слоя, впитавшие воду, и сразу на срезы пипеткой наносят водный или нильский синий, выдерживают в нем 1-2 минуты (поперечные срезы выдерживают дольше, чем продольные) и таким же приемом фильтровальной бумагой удаляют синюю краску. Далее на срезы поочередно наносят 50%, 75% и 96% спирт, выдерживая в каждом, несколько минут и убирая фильтровальной бумагой. Такое же обезвоживание производят несколько раз, пока не будет заметна резкая разница в окраске разных тканей. Этот прием называют дифференцировкой окраски.

Сафранин окрашивает одревесневшие элементы, а нильский синий нелигнифицированные, тонкостенные. Последним наносят 100% спирт, но если для обезвоживания используют 5-20% карбол-ксилол (смесь фенола с ксилолом), а это чаще всего, то его наносят после 96% спирта, минуя промывку в абсолютном спирте. Эта смесь обладает прекрасным просветляющим и обезвоживающим свойствами, продолжительность выдержки в ней зависит от интенсивности окраски. Убрав бумагой карбол-ксилол, срезы заливают ксилолом. В течение всей дифференцировки (проводки) после каждого погружения осторожно препаровальной иглой корректируют положение срезов на предметном стекле, чтобы они оказались в средней части. Не следует допускать подсыхания срезов, т.к. они свертываются в трубочку.

Трудно рекомендовать время выдержки срезов в каждом из реактивов, т.к. это зависит от толщины среза, характера объекта. Если в процессе дифференцировки срезы плохо обезвожены, они помутнеют при погружении их в ксилол. На прокрашенные и обезвоженные срезы наносят канадский бальзам и закрывают покровным стеклом, опуская его под некоторым углом к предметному стеклу, что способствует удалению воздуха. Количество наносимого бальзама устанавливают в процессе работы, и оно зависит от толщины среза, величины покровного стекла. Важно, чтобы все срезы были закрыты, покровное стекло полностью прилегало к предметному, и бальзам не вытекал в избытке.

После подсыхания в течение нескольких дней препарат маркируют или карандашом по стеклу, или наклеивают этикетку (при изготовлении учебных препаратов фабричным способом). Нельзя препараты держать на сильно освещенных местах, так как они выцветают.

Многие растения (лимонник, липа, пихта, актинидия и др.) содержат многочисленные слизевые идиобласты. Слизь затрудняет работу, т.к. срезы прилипают к фильтровальной бумаге и снять их без повреждения не удается. Избавиться от них можно кипячением в воде, но при этом мягкие ткани коры могут мацерироваться. Лучше заспиртованный материал (срезы) выдержать в 10%-ом водном растворе уксусно-кислого свинца, т.к. слизи теряют способность к набуханию.

4.7.3 Изготовление постоянных препаратов в глицерин-желатине

Этот способ изготовления постоянных препаратов используют в том случае, если хотят оставить неокрашенные препараты (эпидерма листа, мезофилл и т.д.). Окрашенные срезы в глицерин-желатине раскрашиваются. Это быстрый способ изготовления препаратов, причем некоторые структуры на них выявляются резче, чем неокрашенные.

Для приготовления глицерин-желатина берут 1 г желатина, 6 мл дистиллированной воды и 7 мл чистого глицерина. На 100 частей этой смеси добавляют 1 г карболовой кислоты (фенол). Сначала смачивают желатин в указанном количестве воды и оставляют набухать 2 часа, затем приливают глицерин и карболовую кислоту. Смесь при помешивании нагревают, пока желатин не растворится до равномерной консистенции. Затем сразу фильтруют через стеклянную вату с помощью воронки с двойными стенками, наполненной горячей водой. Можно пользоваться обычной воронкой, которую необходимо подогревать кругом, не давая ей остыть.

Для получения совершенно прозрачного желатина в теплый раствор глицерин-желатина рекомендуется добавить яичный белок, и нагреть до кипения, размешивая стеклянной палочкой. При этом белок свертывается, адсорбирует все примеси, обуславливающие муть. Глицерин-желатин нагретым надо профильтровать, но после этого мешать смесь ни в коем случае нельзя, т.к. образовавшиеся пузырьки воздуха будут попадать на препараты, а в отличие от канадского бальзама, из которого пузырьки воздуха очень хорошо исчезают, из глицерин-желатина они практически не удаляются. Хранить глицерин-желатин надо в колбе с широким дном, закрывая ее корковой пробкой, в которую через отверстие вставляют стеклянную палочку.

В комнатных условиях глицерин-желатин застывает, поэтому перед работой и в процессе изготовления препаратов его подогревают на водяной бане.

Объекты из мягких тканей в глицерин-желатине сжимаются, поэтому перед нанесением среза на предметное стекло, его сначала помещают в раствор глицерина с водой (1:9). Вода постепенно испаряется, и когда густота глицерина станет достаточной, срез помещают в глицерин-желатин под покровное стекло.

Срезы древесины такой процедуре не подвергают, а прямо из воды помещают под стекло. Избыток глицерина удаляют фильтровальной бумагой. Перед изготовлением предметное стекло слегка нагревают над спиртовкой, кладут срез, помещают на него несколько капель глицерин-желатина и накрывают покровным стеклом, опуская его постепенно на одно ребро наклонно. Тогда покровное стекло, опускаясь, вытесняет воздух. После опускания стекла его не прижимают и не надавливают (в отличие от помещения в канадский бальзам), не сдвигают. Для хранения препарата покровное стекло заключают в рамочку из канадского бальзама, расплавленного воска или парафина, перед этим удаляя выступивший из-под стекла глицерин-желатин.

После изготовления препаратов, особенно при использовании канадского бальзама, им необходимо «подсохнуть». Ксилол, в котором растворяют канадский бальзам, испаряется, и покровное стекло прочно прикрепляется к предметному. Теперь необходимо произвести анализ объектов. Его характер зависит от целей исследования.

Если производится описание структуры нового объекта, о котором данных в литературе нет, то дают подробную его характеристику. Исследуя несколько срезов (они могут быть под одним стеклом), устанавливают общую картину структуры. Определяют гистологический состав объекта, топографию (расположение) тканей на разных срезах, их параметры, соотношение, наличие идиобластов и др.

Затем производят подробное описание, отмечая как общие, так и характерные особенности. Ткани описывают не в произвольном порядке, а в порядке их расположения в органе (в стебле – от центра к периферии, или наоборот; в листе от верхней стороны к нижней, или наоборот). Описание сопровождают количественными характеристиками, производя замеры винтовым окуляр-микрометром, а если его нет, то мерной линейкой, вставляемой в окуляр. Предварительно определяют цену деления на всех увеличениях.

- наличие устьиц и тип устьичного аппарата, их количество на единицу площади;

- размеры эпидермальных клеток на поперечных и продольных срезах;

- характер утолщения оболочки (вся ли утолщена или отдельные стенки, утолщение равномерное или нет);

- наличие составных тканей (феллемы, феллодермы, феллогена, так как феллодерма часто может отсутствовать);

- количество клеток феллемы в радиальном ряду в границах годичного слоя;

- наличие содержимого в клетках феллемы и других тканей;

- наличие хлоропластов, идиобластов, кристаллов;

- наличие утолщений оболочки и характер утолщения;

В феллодерме обычно отмечают ее ширину, сложение, форму клеток.

- наличие в клетках хлоропластов, кристаллов;

- отличие от прилегающих клеток феллодермы и паренхимы первичной коры.

4. В паренхиме первичной коры – (обычно это наиболее развитая ткань молодых стеблей) необходимо отметить:

- форму клеток на поперечном и продольном срезах;

- сложение (плотное, рыхлое с хорошо развитой сетью межклетников);

- наличие, форма, размер, локализация кристаллов оксалата кальция;

- расположение (сплошным кольцом, участками);

- характер расположения аксиальной паренхимы;

- наличие механических элементов и их расположение;

- дифференциацию на проводящую, непроводящую, дилатационную зоны;

- тип и локализацию кристаллов оксалата кальция;

- форму поперечного сечения ситовидных элементов;

- тип ситовидных пластинок и форму ситовидных полей.

- тип (рассеянно-сосудистая, кольцесосудистая или переходного типа);

- рисунок расположения просветов сосудов и их количество на единицу площади;

- наличие трахеид, волокнистых трахеид, либриформа;

- тип перфорации и межсосудистой поровости и сосудов;

- тип сердцевинных лучей, их структуру, наличие в них идиобластов, оксалата кальция;

Методика описания вторичной ксилемы очень подробно дана в книге А.А. Яценко-Хмелевского (1954), которую каждому исследователю необходимо проработать весьма тщательно.

Сравнительный анализ может быть выполнен в следующих двух аспектах:

1. Сравнение структур органов представителей разных таксонов (видов, родов, семейств), при этом больше внимания уделяется качественным признакам, не подверженных влиянию среды, и количественным характеристикам: тип и форма ситовидных пластинок, тип лучей, форма и место локализации оксалата кальция, тип древесины, гистологический состав тканей, выраженность годичной слоистости и т.д.

2. Сравнение представителей одного вида в зависимости от условий произрастания. Сейчас уже установлено, что ни естественные, ни антропогенные факторы практически не влияют на качественные признаки, а значит, большее внимание уделяется количественным. Производят отбор параметров, по которым сравнивают образцы и осуществляют измерения. Обязательно вычисляется достоверность различия между ними. Только в этом случае можно будет говорить о доказанности или недоказанности влияния фактора.

Если производятся наблюдения за формированием органа, т.е. образцы отбираются через равные промежутки времени в течение вегетационного сезона, то прослеживаются изменения как качественных, так и количественных признаков.

Как мы уже отмечали выше, в сравнительных исследованиях очень важна количественная характеристика объекта и его структур. Для производства измерений под микроскопом необходимо иметь объект-микрометр и окуляр-микрометр. Объект-микрометр – это металлическая пластинка, в которую вмонтировано небольшое стекло с нанесенной штриховой линейкой: 1 линейный мм поделен на 100 делений, т.е. каждое деление соответствует 10 мкм.

Винтовой окуляр-микрометр устанавливают вместо окуляра. В нем вмонтирована стеклянная шкала, имеющая 8 делений. Вдоль шкалы при помощи винта, на котором вмонтирован вращающийся барабан с нанесенными по его окружности делениями (100), перемещается подпружиненный движок. На перемещающемся стекле движка нанесены две линии, перекрещивающиеся под прямым углом и две параллельные линии над местом перекреста.

Прежде чем производить измерение, необходимо определить цену деления шкалы барабана. Она определяется для каждого объектива.

Для определения цены деления вместо постоянного препарата на предметный столик помещают объект-микрометр. Винтовой окуляр-микрометр надевают на тубус вместо окуляра. Установив на резкость линейку объект-микрометра, совмещают крайние штрихи линейки на объект-микрометре и в окуляр-микрометре, затем совмещают две параллельные линии с началом линейки (вращая барабан), при этом «0» вращающегося барабана должен совпасть с неподвижным штрихом. Отводя барабаном параллельные линии от нулевого штриха до совпадения с любым штрихом объект-микрометра (но не на полный оборот) подсчитывают число делений по шкале объект-микрометра до параллельных линий и умножают на 10 (одно деление объект-микрометра равно 10 мкм), и, поделив эту цифру на число делений барабана, на которое он переместился от «0», получают цену деления барабана. Цена деления одного большого деления шкалы окуляр-микрометра равна полному обороту – 100 делениям барабана.

Чтобы измерить величину обьекта под микроскопом, после наведения на резкость, совмещают нулевой штрих с началом обьекта, подсчитывают сколько больших делений линейки уместилось на объекте, а оставшуюся часть измеряют вращением барабана.

Допустим, по диаметру клетки поместилось 2 больших деления (100 делений барабана × 2 = 200), после штриха «2» барабан вращают от нуля до совмещения с концом объекта и отсчитывают число делений по барабану, на которое он переместился. Длина объекта в делениях барабана равна 200 плюс число делений барабана (допустим 25). Общая длина 225 делений барабана. Зная цену деления, умножаем на него длину объекта в делениях, получим длину в микронах.

При описании анатомического строения стебля растений необходимо использовать количественные показатели, но нужно иметь в виду, что они варьируют в очень широких пределах, т.к. процесс роста растений испытывает мощное «давление» экологических факторов. Следовательно, обычные размеры элементов даются в разбеге «от» и «до» (например, диаметр сосудов варьирует в пределах 100-150 мкм).

Обязателен математический аппарат в сравнительных исследованиях: анализ влияния экологических факторов, влияние возраста, видовой принадлежности. В том случае должна осуществляться статистическая обработка. В анатомии растений, как и в целом в биологии, вполне приемлем уровень статистической значимости 5% (W=5), соответственно, доверительный уровень равен 95%.

Для получения необходимого показателя производят 25 измерений и обрабатывают неранжированный вариационный ряд. Среднюю арифметическую вариационного ряда (

) вычисляют по формуле:

После этого определяют величину колебания значений вариант около их средней арифметической, которое характеризуется средним квадратическим отклонением (

). Вместе со средней арифметической (

) этот показатель используется для вычисления других показателей. Среднее квадратическое отклонение в квадрате (

) называется дисперсией.

Этот показатель характеризует рассеянность вариант около

Для оценки достоверности средней арифметической вычисляется её ошибка:

Достоверность средней арифметической оценивают по критерию Стьюдента:

Средняя арифметическая считается достоверной, если вычисленное значение

выше табличного. Если же оно меньше табличного, это означает, что или недостаточен объём выборки, для которой найдена средняя величина, или данные не однородны.

В результатах обработки среднюю арифметическую приводят вместе с ошибкой:

Среднее квадратическое отклонение характеризует степень отклонения вариант данной совокупности от средней арифметической в абсолютных числах. Однако, для сравнения совокупностей по их вариабельности необходимо вычислить коэффициент вариации (

), который показывает, какой процент составляет

от средней арифметической:

85-104% – варьирование признака очень большое;

более 105% – варьирование признака аномальное.

Важным показателем является точность опыта, который выражает величину ошибки средней арифметической в процентах от самой средней арифметической, т.е. служит показателем точности определения последней:

Точность опыта считается удовлетворительной, если величина показателя не превышает 5%. При значении более 5%, рекомендуется увеличить число наблюдений или повторностей.

Во многих случаях для получения более полного представления о строении элементов, необходимо проводить мацерацию материала путём разрушения межклеточного вещества, в котором преобладает пектин, что вызывает распад ткани на составляющие её клетки. Можно использовать несколько способов мацерации:

1. Кипячение в воде – используется для мацерации мелких и нежных тканей. Так при кипячении клубней картофеля материал распадается на отдельные клетки.

2. Кипячение материала в течение нескольких минут в едком кали различной концентрации (5-50%) в зависимости от плотности материала. После обработки щёлочью материал промывают водой.

3. Если межклеточное вещество не пропитано или слабо пропитано лигнином, что имеет место у травянистых растений, то применяют способ Мажена. Объект помещают на 24 часа в подкисленную воду или подкисленный спирт (3-5 частей 96% спирта и 1 часть соляной кислоты), после чего объект переносят в 10% раствор аммиака также на 24 часа. После такой выдержки кусочки материала при надавливании пинцетом, кисточкой, иглой легко расчленяются на отдельные клетки. Если расчленение на отдельные структуры происходит с трудом, то используют 30%-ный аммиак. При таком способе мацерации хорошо сохраняется содержимое клетки.

4. Крепкий 30%-ный водный раствор хромового ангидрида. Его используют для мацерации твердого материала (древесина, скорлупа орехов и т.д.). Лезвием опасной бритвы готовят не очень толстые срезы, которые помещают в раствор не более чем на 5 минут, после чего быстро промывают водой. После обработки по этому методу материал легко распадается на элементы.

Необходимо помнить, что объект, подвергаемый мацерации, должен быть однородным. Нельзя мацерировать кусочек, содержащий древесину и флоэму одновременно, т.к. в одном и том же реактиве ткани требуют разной продолжительности воздействия (экспозиции). Пока твердая часть достигает необходимой консистенции, мягкая уже разрушается.

Мацерированный материал можно покрасить эозином, сафранином, гематоксилином. После промывки водой и дегидратации объект можно заключать в канадский бальзам и готовить постоянные препараты.

1. Абакумов В.А., Максимов В.Н., Ганьшина Л.А. Экологические модуляции как показатель изменения качества воды // Научные основы контроля качества вод по гидробиологическим показателям: Тр. Всес. конф. – Л., 1981. С. 117-136.

2. Абросов В. Н. О видообразовании в озерах. - М.: Наука, 1987. - 85 с.

3. Бульон В.В. Закономерности первичной продукции в лимнических экосистемах. - СПб.: Наука, 1994. – 222 с.

4. Винберг Г.Г. Некоторые общие вопросы продуктивности озер // Зоол. журн. 1936. Т. 15. Вып. 4. С. 587 - 603.

5. Винберг Г.Г. Интенсивность обмена и пищевые потребности рыб. – Минск: Изд. Белорус. Ун-та, 1956. – 254 с.

6. Винберг Г. Г. Первичная продукция водоемов. – Минск: Изд-во АН БССР, 1960. – 328 с.

7. Винберг Г.Г. Зависимость энергетического обмена от массы тела у водных пойкилотермных животных // Журн. общ. биол. 1976. Т. 37. Вып. 1. С. 56-70.

8. Винберг Г. Г. Общие основы изучения водных экосистем. – Л.: Наука, 1979а. – 273 с.

9. Винберг Г.Г. Опыт применения разных систем биологической информации загрязнения вод в СССР // Влияние загрязняющих веществ на гидробионтов и экосистемы водоемов. – Л.: Наука, 1979б. С. 43-51.

10. Винберг Г.Г. Опыт применения разных систем биологической индикации загрязнения вод в СССР // Влияние загрязняющих веществ на гидробионтов и экосистемы водоемов. – Л., Наука, 1979в. С. 285-292.

11. Винберг Г.Г. Температурный коэффициент Вант-Гоффа и уравнение Аррениуса в биологии // Журн. общ. биол. 1983. Т. 44. № 1. С. 3-42.

12. Винберг Г.Г., Анисимов С.И. Математическая модель водной экосистемы // Фотосинтезирующие системы высокой продуктивности. – М.: Наука, 1966. С. 213-223.

13. Гаазе-Рапопорт М.Г., Поспелов Д.А. От амебы до робота: модели поведения. – М.: Наука, 1987. – 285 с.

14. Грунты. Методы лабораторного определения гранулометрического и микроагрегатного состава: ГОСТ 12536-79; введен 01.07.1979 г. //Государственный комитет СССР по делам строительства – М.: ИПК Издательство стандартов, 1980. – 24 с.

15. Джапаридзе Л.И. Практикум по микроскопической химии растений. М., 1953. – 52 с.

16. Долгов Г.И., Никитинский Я.Я. Гидробиологические методы // Стандартные методы исследования питьевых и сточных вод. – М.: Мосполиграф, 1927. С.142-217.

17. Зайцев Н.Г. Математика в экспериментальной ботанике. М., 1990. – 295 с.

18. Ивлев В.С. - Экспериментальная экология питания рыб (1955). 253 с.

19. Ивлев В.С. О превращении энергии при росте беспозвоночных // Бюлл. МОИП. Отд. биол. 1938. Т. 47, № 4. С. 267-277.

20. Израэль Ю.А. Глобальная система наблюдений. Прогноз и оценка изменений состояния окружающей природной среды. Основы мониторинга // Метеорология и гидрология. 1974. № 7. С. 3-8.

21. Израэль Ю.А. Концепция мониторинга состояния биосферы // Мониторинг состояния окружающей природной среды. Тр. 1 советско-англий-ского симпозиума. – Л.: Гидрометеоиздат, 1977. С. 10-25.

22. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды. – М.: Гидрометеоиздат, 1984. – 560 с.

23. Израэль Ю.А., Абакумов В.А. Об экологическом состоянии поверхностных вод СССР и критериях экологического нормирования // Экологические модификации и критерии экологического нормирования. – Л.: Гидрометеоиздат, 1991. С. 7-18.

24. Комаров В.Л. Практически курс ботаники. Ч. I., Л., 1923. – 289 с.

25. Кожова О.М. Применение методов экосистемного анализа к оценке качества вод (на примере Ангары и Байкала). // Научные основы контроля качества поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Тр. Советско-английского семинара. – Л.: Гидрометеоиздат, 1977. С. 16-29.

26. Кожова О.М. Прогноз состояния водных экосистем и приемы экологической оценки действия антропогенных факторов // Прогнозирование экологических процессов. – Новосибирск: Наука, 1986. С. 27-34.

27. Кожова О.М., Ащепкова Л.Я., Загоренко Г.Ф. Исследование некоторых методов биологического контроля рек // Гидробиологические исследования в Восточной Сибири. Чтения памяти проф. М.М. Кожова. - Иркутск: Изд. ИГУ. 1979. Вып. 3. С. 67-82.

28. Макрушин А.В. Биологический анализ качества вод. Л.: ЗИН АН СССР, 1974. - 60 с.

29. Меншуткин В.В. Математическое моделирование популяций и сообществ водных животных. – Л.: Наука, 1971. – 196 с.

30. Меншуткин В.В., Кожова О.М., Ащепкова Л.Я. Модель сезонной динамики экосистемы озера Байкал // Модели природных систем. – Новосибирск, Наука, 1978. С. 57-64.

31. Меншуткин В.В., Кожова О.М., Ащепкова Л.Я., Кротова В.А. Камерная модель динамики экосистемы озера Байкал с учетом трехмерной циркуляции вод // Математическое моделирование водных экосистем. – Л.: Гидрометеоиздат, 1981. С. 288-298.

32. Меншуткин В.В., Умнов А.А. Математическая модель простейшей водной экологической системы // Гидробиол. журн. 1970. Т. 6. Вып. 2. С. 28-35.

33. Методические указания. Методика выполнения измерений массовой концентрации взвешенных веществ и общего содержания примесей в водах весовым методом: введен 17.04.95 г. // Начальник ГУЭМЗ Росгидромета Цатуровым Ю.С. – Ростов-на-Дону, 1995. – 8 с.

34. Прозина М.И. Ботаническая микротехника. М., 1960. – 205 с.

35. Россолимо Л.Л. Основы типизации озер и лимнологического районирования // Накопление вещества в озерах. – М.: 1964. С. 5-46.

36. Руководство по гидробиологическому мониторингу пресноводных экосистем. – СПб.: Гидрометеоиздат, 1992. – 318 с.

37. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / Под ред. В.А. Абакумова. – Л.: Гидрометеоиздат, 1983. – 239 с.

38. СанПиН 2.1.4.1074-01. Санитарные правила и нормы. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. – М.: Минздрав России, 2002. – 103 с.

39. Яценко-Хмелевский А.А. Основы и методы анатомического исследования древесины. М. - Л., 1954. – 337 с.

40. Kolkwitz R., Marsson M. Grundsatze fur die biologishe Beurtheilung des Wassers hach seinerFlora und Fauna // Mitteil. aus der konigl. Prufungang fur Wasserbesorg. und Abwasserbes. 1902. H. 1. S. 33.

41. Шорыгин А.А Питание и пищевые взаимоотношения рыб Каспийского моря. – М.: Пищепромиздат, 1952, 268 с.

42. Теоретические вопросы классификации озер / Отв. ред. Н.П. Смирнов – СПб.: Наука, 1993. – 185 с.

43. Тимофеев-Ресовский Н.В., Яблоков А.В., Глотов Н.В. Очерк учения о популяции. – М.: Наука, 1973. – 277 с.

44. Шеннон К. Математическая теория связи / Работы по теории информации и кибернетике. – М.: Ин. литер., 1963. С. 243-332.

45. Экологический мониторинг. Методы биомониторинга / Под ред. Д.Б. Гелашвили. – Н. Новгород: ННГУ, 1995. Вып. 1. – 190 с.

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: