Визначення оптичної густини забарвлених розчинів у залежності від їх концентрації.

Кожна речовина має свій спектр поглинання з максимумом при певній довжині хвилі. Тому концентрації розчинів різних речовин вимірюють при довжині хвилі, що відповідає максимуму поглинання.

Дослід 1.Виміряти оптичну густину (А) розчину, що містить різну кількість фосфору.

Принцип методу. Фосфати в розчині сульфатної кислоти утворюють з молібдатами фосфорно-молібденові комплекси, які відновлюються до молібденової сині. Кількість фосфатів визначають колориметрично (за інтенсивністю забарвлення) за реакцією утворення комплексної фосфорно-молібденової кислоти та її відновлення до молібденової синьки.

Матеріальне забезпечення: стандартний розчин фосфору 0,32 мM, молібденовий реактив, пробірки, піпетки, фотоелектроколориметр (ФЕК).

Хід роботи: У п’ять пробірок додають розчини у кількостях, наведених нижче в таблиці:

Розчини змішують і не раніше, ніж через 2 хв, але не пізніше, ніж через 5 хв, вимірюють величину оптичної густини на ФЕКу, використовуючи червоний світлофільтр. За результатами вимірювань будують графік залежності оптичної густини від концентрації фосфору в мкмоль/мл.

Зробити висновок. Пояснити вплив концентрацій речовин на величину оптичної густини.

Дослід 2. Визначення наявності білків у розчині методом осадження сульфосаліциловою кислотою.

Принцип методу. Білки легко осаджуються із водного розчину мінеральними, органічними кислотами та солями важких металів. Денатурація і осадження білка кислотами обумовлюється нейтралізацією поверхневого заряду колоїдних частинок білка, руйнуванням гідратаційної оболонки білкових молекул та утворенням комплексних солей білка з кислотами. Важкі метали утворюють стійкі комплекси з SH-групами білків, що викликає зміни структури та втрату розчинності білка. Особливо чутливою реакцією на наявність білка в розчині є осадження трихлорацетатною та сульфосаліциловою кислотою (чутливість останньої реакції складає 1:50000). Крім того, сульфосаліцилова кислота здатна осаджувати поряд з високомолекулярними білками, низькомолекулярні білки та продукти розпаду білків – поліпептиди і олігопептиди.

Матеріальне забезпечення: пробірки, розчин білка, 20 %-ний розчин сульфосаліцилової кислоти.

Хід роботи: У пробірку наливають 1,0 мл досліджуваного розчину білка та додають 3 – 5 крапель 20 %-го розчину сульфосаліцилової кислоти. Спостерігають за утворенням осаду білка.

Клініко-діагностичне значення. Реакція з сульфосаліциловою та трихлорацетатною кислотами використовується для якісного та кількісного визначення білка в сечі.

Здатність білка міцно зв’язувати іони важких металів використовується в клінічній практиці. Білок використовують як протиотруту при отруєннях солями ртуті, свинцю тощо. У разі отруєння солями важких металів хворому дають велику кількість білка (яєчного білка або молока). В шлунку утворюються нерозчинні комплекси металів з білками, внаслідок чого припиняється всмоктування отрути в кров, послаблюється інтоксикація та посилюється їх виведення з організму.

Дослід 3. Кількісне визначення білка в досліджуваному розчині шляхом вимірювання оптичної густини колориметричним методом (Біуретова реакція).

Принцип методу. Біуретова реакція – характерна реакція на сполуки, що містять в своєму складі не менше двох пептидних зв’язків. Такі сполуки в лужному середовищі утворюють з купруму сульфатом (мідним купоросом) комплекс, забарвлений у рожево-фіолетовий колір. В утворенні цього комплексу беруть участь пептидні зв’язки в енольній формі. Біуретова реакція служить доказом наявності пептидних зв’язків у білках та пептидах.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, калій-натрій виннокислий, міді сульфат, 0,9 % розчин NаCl, 10 % розчин NaOH, мірні пробірки, піпетки на 1, 2 і 10 мл, ФЕК, біуретовий реактив: 0,15 г CuSO₄ · 5 Н₂О; 0,6 г калію-натрію виннокислого і 50 мл Н₂О. Суміш перемішують і додають 30 мл 10 % розчину NаОН, 0,1 г калію йодиду і доводять водою до об’єму 100 мл (зберігають у холодильнику в запарафінованому посуді).

Хід роботи: У першу пробірку вносять 0,1 мл 0,9 % розчину NаCl (контроль), у другу – 0,1 мл стандартного розчину білка (50 г/л), у третю, четверту і п’яту пробірки – по 0,1 мл досліджуваного розчину білка (задачі). У кожну пробірку додають по 5 мл біуретового реактиву, перемішують і через 30 хв визначають екстинкцію за допомогою фотоелектроколориметра в кюветах товщиною 10 мм при синьому світлофільтрі (440 нм) проти контрольного розчину. Поява фіолетового забарвлення (біуретова реакція) свідчить про наявність у розчині білка чи поліпептидів. Інтенсивність забарвлення змінюється залежно від концентрації білка в розчині.

Розрахунок проводять за формулою:

Х= (С ´ А_і) / А_ст, де:

Х – концентрація речовин у дослідній пробі, г/л;

С – концентрація речовин у стандартному розчині;

А_і – оптична густина досліджуваного розчину;

А_ст – оптична густина стандартного розчину білка.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок. Вказати на властивості білків утворювати в лужному середовищі з CuSO₄ комплекс рожево-фіолетового забарвлення.

Кількісно загальний білок можна визначати в сироватці або плазмі крові за допомогою тестового набору реактивів напівавтоматичним біохімічним аналізатором „Stat Faх 1904 plus”.

Клініко-діагностичне значення. Для кількісного визначення білків у біологічному матеріалі найчастіше застосовують фотоколориметричні та спектрофотометричні методи, у деяких випадках застосовують фотонефелометричні методи, а також визначення білка за вмістом загального нітрогену (азотометрія).

У клініко-біохімічних лабораторіях для встановлення діагнозу захворювання проводять визначення концентрації білків у біологічних рідинах організму (крові, сечі, спинномозковій рідині, ексудатах). У нормі вміст загального білка у сироватці крові дорівнює у дорослих 65-85 г/л (6,5-8,5 г %), у дітей до 6 років 56-85 г/л (5,6-8,5 г %).

Колориметричні методи визначення кількості білка базуються на „кольорових” реакціях на функціональні групи білків: біуретова реакція; мікрометод визначення кількості білка за допомогою реактива Бенедикта; метод Лоурі; метод Лоурі в модифікації Святкіна (метод використовують для визначення вмісту білка в препаратах з підвищеним вмістом ліпо- і глікопротеїнів); метод Флореса.

Ультраспектрофотометричний метод визначення кількості білка базується на здатності ароматичних радикалів тирозину, триптофану і меншою мірою – фенілаланіну білка поглинати ультрафіолетове світло з максимумом поглинання при 280 нм.

Визначення вмісту білка сироватки крові рефрактометричним методом, основаним на неоднаковій здатності різних середовищ заломлювати промінь світла, що проходить через них. Відношення синуса кута падіння світла до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення. Величина показника заломлення сироватки крові залежить, головним чином, від вмісту в ній білка. Для визначення показника заломлення використовують спеціальні прилади – рефрактометри.

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычис­лить, когда этот...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: