|
|
Дослід 1. Виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація).Принцип методу. Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях відбуваються реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилування. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, а компоненти дихального ланцюга локалізовані на внутрішній мембрані мітохондрій. Для виділення мітохондрій м’язову тканину розтирають (гомогенізують) у механічному гомогенізаторі з тефлоновим наконечником, додаючи розчин сахарози. Виділення мітохондрій з гомогенату здійснюють на рефрижераторній центрифузі. Швидкість осадження клітинних компонентів під дією відцентрової сили залежить від їх маси, розміру, а також часу центрифугування. Матеріальне забезпечення: свіжі м’язи кроля; розчин № 1 – середовище для виділення мітохондрій (0,25 М розчин сахарози і 0,01 М розчин етилендіамінтетраацетатної кислоти (ЕДТА – для зв’язування кальцію, рН = 7,6); розчин № 2 – середовище для отримання суспензії мітохондрій (0,25 М розчин сахарози в 0,02 М розчині трис-буфера з рН = 7,5). Всі розчини охолоджують до + 2оС. Хід роботи. Тканину м’язівочищають від жиру, подрібнюють, зважують та гомогенізують в десятикратному об’ємі охолодженого розчину № 1 протягом 40 хв. при швидкості обертання – 600 об/хв. Всі подальші процедури проводять при температурі + 1-2оС. Гомогенат звільняють від ядер та уламків клітинних мембран шляхом центрифугування впродовж 6 хв. при 700 об/хв. Отриману надосадову рідину (супернатант) переносять в інші центрифужні пробірки та повторно центрифугують протягом 10 хв при 7000 об/хв. Після видалення надосадової рідини отримують осад мітохондрій. Для очищення мітохондрій, додають вихідну кількість розчину № 1, осад ресуспендують, а потім проводять повторне осадження мітохондрій протягом 10 хв при 7000 об/хв. Осад мітохондрій ресуспендують в невеликому об’ємі розчину № 2, визначають вміст білка. Отриману суспензію мітохондрій використовують для проведення дослідів 2 – 4, а також для дослідження процесів тканинного дихання та окисного фосфорилування.
Дослід 2. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення СО2 та вплив малонової кислоти на цей процес. Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується виділенням СО2. Як джерело ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА. Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО2 не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (бурштинової кислоти). Для зв’язування СО2, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)2. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО2 визначають за виділенням бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сульфатної кислоти. Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин Са(ОН)2, суспензія мітохондрій, 0,1 М розчин H2SO4, термостат, штатив із пробірками, піпетки Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:
Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв при 37оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0 мл 0,1 М розчину H2SO4 і спостерігають за вивільненням бульбашок СО2 За результатами проведеного експерименту зробити висновки.
Дослід 3. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення атомів водню та вплив малонової кислоти на цей процес. Принцип методу. При окисненні ацетил-S-КоА в ЦТК вивільняється водень, який відновлює метиленову синьку та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину, є показником інтенсивності протікання ЦТК в мітохондріях. При блокуванні ЦТК малонатом (малоновою кислотою), вивільнення водню не відбувається і метиленова синька не знебарвлюється. Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин метиленової синьки, суспензія мітохондрій, термостат, штатив із пробірками, піпетки Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:
Зробити висновки.
Дослід 4. Визначення активності ФАД-залежної сукцинат-дегідрогенази – компонента дихального ланцюга мітохондрій. Принцип методу. Сукцинатдегідрогеназа каталізує дегідрогенізацію сукцинату (бурштинової кислоти), в результаті чого утворюється фумарат (фумарова кислота). Кофактором ферменту є ФАД, який відновлюється в процесі реакції до ФАДН2. Утворений в реакції ФАДН2 відновлює метиленову синьку та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин бурштинової кислоти, розчин метиленової синьки, суспензія мітохондрій, 0,1 М розчин H2SO4, термостат, штатив із пробірками, піпетки. Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами згідно табли:
За результатами проведеного експерименту зробити висновки. Клініко-діагностичне значення. Багато речовин, у тому числі і лікарські засоби, можуть змінювати енергетику клітин, інтенсивність окислювального фосфорилування – утворення АТФ. Їх можна поділити на активатори та інгібітори енергетичного обміну. До активаторів належать кислоти циклу Кребса (лимонна, яблучна, бурштинова) та низка інших сполук (глюкоза, амінокислоти тощо), тому вони знайшли застосування у медичній практиці. Лимонну кислоту у вигляді солей (цитрат натрію) використовують як засіб, що запобігає згортанню крові та може входити до складу деяких ліків.   Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...  ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...  Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...  ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала... Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:
|