Сдам Сам

ПОЛЕЗНОЕ


КАТЕГОРИИ







Реакции обратимого осаждения белков





Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми. При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочно-земельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.

Реактивы: раствор яичного белка с добавлением хлорида натрия (белок одного куриного яица отделяют от желтка и растворяют в 230 см3 дистиллированной воды, к которой прибавляют 100 см3 насыщенного раствора хлорида натрия, раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3–4 слоя, и хранят в холодильнике); насыщенный раствор сульфата аммония; сульфат аммония, растертый в порошок; 10 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; воронка для фильтрования; бумажные фильтры.

Ход работы

Задание 1. Осаждение белков сульфатом аммония.

  1. В пробирку отмерьте 2–3 см3 раствора яичного белка, добавьте равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и смесь перемешайте.
  2. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтруйте на бумажном фильтре.
  3. К фильтрату добавьте порошок сульфата аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция не растворяется).
  4. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтруйте.
  5. Фильтр с осадком альбуминов промойте 5 см3 воды, собирая фильтрат в чистую пробирку.
  6. Проделайте с фильтратом биуретовую реакцию. Произошло ли растворение альбуминов?

Задание 2. Осаждение белков спиртом.

Органические растворители вызывают осаждение белков вследствие разрушения гидратной оболочки макромолекул.

  1. В пробирку налейте 1 см3 раствора яичного белка с добавлением хлорида натрия.
  2. По каплям прилейте 4–6 см3 спирта и сильно взболтайте. Через 5–8 мин. выпадает осадок белков.

Реакции необратимого осаждения белков

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация и агрегация белка. Денатурированный белок не способен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реагентов, детергентов, красителей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе №1; концентрированные серная, соляная и азотная кислоты; 5 %-й раствор ацетата свинца; 2,5 %-й раствор нитрата серебра; 5 %-й раствор сульфата меди.

Задание 1. Осаждение белков минеральными кислотами.

Реакция находит применение для быстрого определения белка в биологических жидкостях, например, моче.

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!



  1. В три пробирки налейте по 15–20 капель концентрированных кислот: в первую – серной; во вторую – азотной и в третью – соляной.
  2. Пробирки наклоните под углом 45о и ОСТОРОЖНО (из пипетки) наслоите по стенке раствор белка. Пробирку держите отверстием от себя. На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.
  3. Пробирки осторожно встряхните. Осадки растворяются в серной и соляной кислотах, но не растворяются в азотной кислоте.

Задание 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов. Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути.

Ход работы

  1. В три пронумерованные пробирки налейте по 5-10 капель раствора белка.
  2. В первую пробирку по каплям прибавьте раствор ацетата свинца. Образуется осадок. Добавьте еще несколько капель, осадок должен раствориться в избытке раствора соли.
  3. Во вторую пробирку по каплям приливайте раствор нитрата серебра. Образовавшийся осадок в избытке соли не растворяется.
  4. В третью пробирку прибавьте раствор сульфата меди до появления осадка. Убедитесь, что осадок растворяется в избытке соли.

Оформление результатов

Оформите результаты проведенных исследований в виде таблицы.

Осаждающий реагент Описание осадка Растворимость осадка в избытке реагента
     

 

Тепловая денатурация белка

При нагревании белки денатурируют. На процесс денатурации оказывают сильное влияние рН раствора и добавление электролитов.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе №1); 1%-й раствор уксусной кислоты; 10 %-й раствор уксусной кислоты; 10 %-й раствор гидроксида натрия; насыщенный раствор хлорида натрия.

Оборудование: пробирки, водяная баня или спиртовка.

Ход работы

  1. В пять пронумерованных пробирок налейте по 10 капель раствора яичного белка.
  2. Белок в первой пробирке нагрейте до кипения. Раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг макромолекул), но осадок не образуется. Мицеллы, образованные макромолекулами, сохраняют одноименный заряд, что препятствует их осаждению.
  3. К раствору белка во второй пробирке добавьте одну каплю 1 %-го раствора уксусной кислоты и нагрейте до кипения. Осадок белка выпадает быстро. Заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрической точке.
  4. К раствору белка в третьей пробирке прибавьте 1-2 капли 10 %-ого раствора уксусной кислоты и нагрейте до кипения. Осадок не образуется, так как мицеллы белка приобрели, присоединяя ионы водорода, положительный заряд, что препятствует их осаждению.
  5. В четвертую пробирку добавьте 1–2 капли 10 %-го раствора гидроксида натрия и нагрейте до кипения. Осадок не выпадает. Мицеллы за счет отщепления протонов от карбоксильных групп боковых цепей белка заряжены отрицательно.
  6. В пятую пробирку прибавьте 1–2 капель насыщенного раствора хлорида натрия и нагрейте до кипения. Белок выпадает в осадок.

Оформление результатов.

Оформите результаты исследования, заполнив таблицу и кратко записав механизм денатурирующего действия исследуемого фактора в виде вывода.

 

№ пробирки Добавляемый электролит Наблюдаемый эффект денатурации Вывод

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №3

Выделение казеина из молока

Казеин – важнейший белок молока. Он относится к фосфопротеинам. Остатки фосфорной кислоты в молекуле казеина связаны с остатками серина. При подкислении до рН 4,7 (изоэлектрическая точка казеина) белок выпадает в осадок.

Добавление избытка кислоты вызывает перезарядку белковых молекул и переход их снова в раствор.

Реактивы: молоко цельное обезжиренное; 10 %-й раствор уксусной кислоты; 1 %-й раствор гидроксида натрия; 5 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки, воронка для фильтрования, бумажный фильтр.

Ход работы

Задание 1. Выделение казеина.

  1. В пробирку внесите 2 см3 молока, прибавьте столько же дистиллированной воды и полученную смесь перемешайте.
  2. К раствору прибавляйте по каплям 10 %-й раствор уксусной кислоты до образования осадка. Избегайте избытка кислоты.
  3. Осадок отфильтруйте на бумажном фильтре и промойте несколько раз дистиллированной водой (на фильтре).
  4. Растворите осадок в 1 %-м растворе щелочи. Полученный раствор профильтруйте через смоченный водой фильтр.

Задание № 2. Качественная реакция на белок.

  1. К 1 см3 профильтрованного раствора добавьте 1 каплю раствора сульфата меди. Образуется характерное для белков красно-фиолетовое окрашивание.

Оформление результатов

Опишите ход выполнения работы. Объясните наблюдаемые явления.

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №4

Диализ растворов белков

Метод диализа основан на неодинаковой способности компонентов раствора к диффузии через тонкие пленки – мембраны, обладающие избирательной проницаемостью. Мембрана представляет собой пористую пленку, через поры которой могут проникать небольшие молекулы. Метод диализа используется для очистки высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных, а также концентрирования растворов полимеров.

Реактивы: водный раствор белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе №1); насыщенный раствор хлорида натрия; 0,5 %-й раствор нитрата серебра; 10 %-й раствор азотной кислоты; 10 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки, целлофановый мешочек; стакан.

Ход работы

Задание 1. Диализ

  1. В пробирке смешайте равные объемы раствора белка и насыщенного раствора хлорида натрия.
  2. Влейте приготовленный раствор белка в мешочек из целлофана, заполнив его до половины.
  3. Мешочек подвесьте на стеклянной палочке и погрузите в стакан с дистиллированной водой. Ионы натрия и хлорид-ионы свободно проникают через стенки мешочка и равномерно распределяются по всему объему воды. Молекулы белка имеют большие размеры, чем размеры пор целлофана, и остаются в мешочке. Диализ проводят при комнатной температуре в течение 20 мин.

Задание 2. Анализ воды в стакане

  1. К 1 см3 жидкости из стакана добавьте 2 капли раствора азотной кислоты и 2–3 капли раствора нитрата серебра. Появляется белый осадок хлорида серебра.
  2. К 1 см3 жидкости из стакана добавьте 5 капель раствора щелочи и 1–2 капли раствора сульфата меди. Фиолетовое окрашивание, характерное для белков, отсутствует.

Задание 3. Анализ содержимого мешочка.

  1. К 5 каплям раствора из мешочка добавьте 5 капель раствора щелочи и 1–2 капли раствора сульфата меди. Появляется характерное окрашивание, вызванное образованием комплексной соли меди с полипептидом.

Оформление результатов

Коротко опишите ход выполнения работы. Сделайте схематический рисунок диализа. Сделайте вывод о распределении низко- и высокомолекулярных веществ до и после диализа.

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №5

Определение изоэлектрической точки желатины

В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы. Молекулы белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. Выпадение белка в осадок можно ускорить добавлением водоотнимающих веществ, например, этилового спирта.

Желатина (желатин) – полидесперсная смесь полипептидов (молекулярная масса–50–70 тыс. Д), образуемая из коллагена.

Реактивы: 0,5 %-й раствор желатины;0,1 М раствор уксусной кислоты;0,1 М раствор ацетата натрия; 96 %-й этиловый спирт.

Оборудование: пробирки; мерные пипетки.

Ход работы

  1. В пять пронумерованных пробирок прилейте растворы уксусной кислоты и ацетата натрия в количествах, указанных в таблице.
  2. После чего в каждую пробирку добавьте по 1 см3 раствора желатины и хорошо перемешайте.
  3. В каждую пробирку прибавьте по 4 см3 этилового спирта и снова перемешайте.
  4. Через 5–10 мин. просмотрите все пробирки и оцените степень мутности полученных смесей. рН наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатины.

Оформление результатов

Результаты опыта оформите в виде таблицы. Определите изоэлектрическую точку желатины.

  № про-ббирки Состав буферной смеси, см3 рН смеси 0,5 %-й раствор желатины, см3 Этиловый спирт, см3 Степень мутнсти (по 5 балльной шкале)
0,1 М СH3COOH 0,1 M СH3COONa
1,8 0,2 3,8  
1,4 0,6 4,4  
1,0 1,0 4,7  
0,6 1,4 5,1  
0,2 1,8 5,7  

 

Тема: Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты – важнейшие биополимеры с относительной молекулярной массой, достигающей 5∙109. Они содержатся во всех без исключения живых организмах и являются не только хранителем и источником генетической информации, но и выполняют ряд других жизненно важных функций. Нуклеиновые кислоты являются полимерами, мономерными звеньями которых являются нуклеотиды.

Существует два различных типа нуклеиновых кислот – дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) и рибонуклеиновые кислоты (РНК). ДНК представляет собой генетический материал большинства организмов. В клетках прокариот, кроме основной хромосомной ДНК, часто встречаются внехромосомные ДНК – плазмиды. В эукариотических клетках основная масса ДНК расположена в клеточном ядре, где она связана с белками в хромосомах. Клетки эукариот содержат ДНК также в митохондриях и хлоропластах.

Молекулы ДНК – самые крупные биологические молекулы. Молекула ДНК E.coli состоит примерно из 4000000 пар нуклеотидов, ее относительная масса равна 26000000000, а длина – 1,4 мм, что в 700 раз превышает размеры ее клетки. Молекулы ДНК эукариот могут достигать еще больших размеров, их длина может составлять несколько см, а относительная масса 1010–1011. Чтобы записать нуклеотидную последовательность ДНК человека, потребуется около 1000000 страниц.

Что же касается РНК, то по выполняемым ими функциям различают:

a) информационные РНК (иРНК) – в них записана информация о первичной структуре белка; б) рибосомные РНК (рРНК) – входят в состав рибосом; в) транспортные РНК (тРНК) – обеспечивают доставку аминокислот к месту синтеза белка. В качестве генетического материала РНК входят в состав ряда вирусов. Например, вирусы, вызывающие такие опасные заболевания, как грипп и СПИД, являются РНК–содержащими.

 
 

Нуклеиновые кислоты могут быть линейными и кольцевыми (ковалентно замкнутыми). Они могут состоять из одной или двух цепей. Ниже приведена схема, отражающая существование в природе различных типов нуклеиновых кислот:

Нуклеиновым кислотам присущи три важнейшие функции: хранение, передача и реализация генетической информации. Кроме этих, они выполняют и другие функции, например, участвуют в катализе некоторых химических реакций, осуществляют регуляцию реализации генетической информации, выполняют структурные функции и др. Роль хранителя генетической информации у большинства организмов (эукариот, прокариот, некоторых вирусов) выполняют двухцепочечные ДНК. Только у некоторых вирусов хранителем генетической информации являются одноцепочечные ДНК или одноцепочечные, а также двухцепочечные РНК. Генетическая информация записана в генах. Ген по своей природе является участком нуклеиновой кислоты. В них закодирована первичная структура белков. Гены могут также нести информацию о структуре некоторых типов РНК, например, тРНК и рРНК.

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №1

Выделение нуклеопротеинов из дрожжей

Реактивы: дрожжи пекарские, прессованные; 1 %–й раствор гидроксида натрия; ацетат натрия; речной песок, тщательно промытый и прокаленный.

Оборудование: ступка с пестиком; воронка для фильтрования, химические стаканы; стеклянная палочка.

Ход работы

  1. К 6 гпекарских дрожжей добавьте 2 см3 воды, немного песка и полученную смесь разотрите в ступке с 1 %–м раствором гидроксида натрия. Раствор щелочи добавляйте небольшими порциями ( по 2 – 3 см3), всего расходуйте около 25 см3. Массу дрожжей растирайте около 15–20 мин до получения гомогенной массы.
  2. Содержимое ступки профильтруйте через складчатый фильтр и перелейте в стакан.
  3. Затем в стакан добавьте 5 г ацетата натрия и, перемешивая стеклянной палочкой, растворите его.
  4. По стенке стакана осторожно наслоите 25 мл этанола. Медленно круговыми движениями перемешайте жидкости. Образуются крупные хлопья нуклеопротеинов, которые постепенно осаждаются на дно стакана.
  5. Отделите осадок нуклеопротеинов фильтрацией на бумажном фильтре или декантацией. Полученные нуклеопротеины сохраните для следующего опыта.

Оформление результатов

Опишите ход выполнения работы.

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №2

Гидролиз нуклеопротеинов

При выполнении данной работы следует соблюдать особую осторожность!

Гидролиз нуклеопротеинов протекает в кислой среде по нижеприведенной схеме.

Реактивы: осадок нуклеопротеинов, полученный в предыдущей работе; 5 %–й раствор серной кислоты; концентрированная серная кислота; 10 %–й раствор гидроксида натрия; 20–25 %–й раствор аммиака; 1 %–й раствор сульфата меди; 1 %–ый спиртовой раствор тимола; 1 %–й раствор нитрата серебра; молибденовый реактив (3,75 г молибдата аммония растворяют в 50 см3 воды и добавляют 50 см3 32 %–го раствора азотной кислоты (плотностью 1,200 г/ см3). Полное растворение молибдата аммония происходит при добавлении кислоты).

Оборудование: круглодонная колба с обратным холодильником; электрическая плитка; воронка для фильтрования; индикаторная бумага; бумажный фильтр.

Ход работы

Задание 1. Гидролиз нуклеопротеинов.

  1. Осадок нуклеопротеинов, полученный в предыдущей работе, растворите в 25 см3 5 %–го раствора серной кислоты и перенесите в круглодонную колбу.
  2. Колбу закройте пробкой с обратным холодильником. Реакционную смесь нагрейте на электрической плитке до кипения и кипятите в течение 1,5 ч.
  3. Смесь охладите и профильтруйте через бумажный фильтр. С фильтратом проделайте реакции нижеследующих заданий.

Задание 2. Обнаружение полипептидов.

  1. К 2 см3 фильтрата прилейте 2 см3 10 %–го раствора щелочи и 2 капли раствора сульфата меди. Образуется характерное для полипептидов окрашивание.

Задание 3. Обнаружение пуриновых оснований.

  1. К 5 каплям 1 %– го раствора нитрата серебра приливайте концентрированный раствор аммиака до растворения образовавшегося вначале осадка.
  2. В другую пробирку влейте 2 см3 фильтрата (задание 1) и приливайте к нему концентрированный раствор аммиака до щелочной по индикаторной бумаге реакции.
  3. Во вторую пробирку влейте содержимое первой пробирки. Через несколько минут выпадают хлопья солей пуриновых оснований.

Задание 4. Обнаружение пентоз.

  1. К 1 см3 фильтрата добавьте 2–3 капли 1 %–го раствора тимола и по стенке пробирки ОСТОРОЖНО наслоите

1 см3 концентрированной серной кислоты. Жидкость окрашивается в красный цвет.

Задание 5. Обнаружение фосфорной кислоты.

  1. К 1 см3 фильтрата прилейте равный объем молибденового реактива.
  2. Содержимое пробирки нагрейте до кипения и кипятите в течение 2–3 минут. Появляется желтое окрашивание, обусловленное образованием комплексной соли. При стоянии выпадает желтый осадок.

Оформление результатов

Опишите ход выполнения работы, опишите компоненты входящие в состав нуклеопротеинов

Лабораторная работа № 3

ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ИЗ ПЕЧЕНИ

Реактивы: 5% й раствор хлорида натрия, дифениламиновый реактив (1г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты,

+ 2,75мл H2SO4 конц.), печень, дистиллированная вода.
Оборудование:гомогенизатор, центрифуга, центрифужные весы, центрифужные пробирки, стакан химический на 100 мл, пипетка на 10 мл, цилиндры на 25 и 50 мл, стеклянные палочки, штатив с пробирками, водяная баня

Ход работы

Навеску ткани печени 500 – 100 мг гомогенизируют в 5—10 мл 5% го раствора хлорида натрия. Полученный гомогенат переносят в центрифужные пробирки, уравновешивают их на цент­рифужных весах и центрифугируют 10 – 15 минут при 1500 – 3000 об/мин

Надосадочную жидкость делят на 2 части. В одной из пробирок проводят качественную реакцию на ДНК (см. ниже). Вторую пробирку помещают в кипящую водяную баню, предварительно добавив 3 мл 2 % го раствора серной кислоты для проведения гидролиза (гидролиз проводят в течении часа). Гидролизат охлаждают, центрифугируют. В надосадочной жидкости содержатся составные компоненты нуклеопротеидов. Надосадочную жидкость разделяют на 3 части и проводят следующие качественные реакции: 1) на пуриновые основания, 2) на углеводную группировку, 3) на фосфорную кислоту.

Реакция на ДНКК 10 каплям раствора при­ливают 1015 капель дифениламинового реактива, пере­мешивают и ставят в кипящую водяную баню на 10 – 15 минут. При нагревании дезоксирибонуклеопротеиды гидролизуются, а освободившаяся дезоксирибоза реагирует с дифениламином. Раствор дифениламина в смеси с уксусной и серной кислотами дает при нагре­вании с дезоксирибозой серо–синее окрашивание.

1. Проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного раствора аммиака для нейтрализации и 5 капель 1% го раствора AgNO3. При стоянии выпадает рыхлый осадок бурого цвета, обусловленный образованием соедине­ний серебра с пуриновыми основаниями.

2. Качественные реакции на углеводы (рибозу и дезоксирибозу).Эти реакции основаны на способности рибозы и дезоксирибозы восстанавливать ионы металлов (медь, висмут, железо) в щелоч­ной среде.

К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30% го раствора гидроксида натрия и несколько капель 7 % го раствора сульфата меди до появления неисчезающей мути гидро­окиси меди (II) Сu(ОН)2. При нагревании до кипения выпа­дает желтый осадок гидрата меди (I) СuОН или красный осадок оксида меди (I) Сu2О.

3 Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель молибденово­го реактива, представляющего собой раствор молибденовокислого аммония в азотной кислоте, и кипятят. При охлаждении пробирки под струей холодной водопровод­ной воды выпадает кристаллический осадок лимонно–желтого цвета, обусловленный образованием фосфорно–молибденовокислого аммония

Лабораторная работа №4

Характеристика препаратов нуклеиновых кислот

Реактивы: раствор ДНК – 0,003 %.

Оборудование: спектрофотометр, термостат.

Ход работы

Чистоту препаратов нуклеиновых кислот определяют по спектру поглощения препарата в ультрафиолетовой области и по величине отношений Е260 : Е230 и Е240 : Е280.

В спектрофотометрическую кювету наливают 3 мл раствора ДНК (0,003%) и на спектрофотометре измеряют оптическую плотность (Д) при длине волн: 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 нм.

На основе полученных данных строят график зависимости Д (ДНК) от длины волны, т.е спектр поглощения ДНК. Находят максимум поглощения в ультрафиолетовом свете препарата ДНК. Затем определяют отношения Е260 : Е230 и Е240 : Е280. Для препаратов нуклеиновых кислот достаточно хорошо очищенных от примесей белков и полисахаридов, эти показатели должны быть в пределах 2,1 – 2,4. Делают вывод о чистоте исследованного препарата ДНК.

Лабораторная работа №5

Количественное определение ДНК

Метод основан на свойстве дезоксирибозы, входящей в состав ДНК, образовывать синее окрашивание прямо пропорциональное концентрации ДНК.

Реактивы: дифениламиновый реактив (1 г дифениламина в 100 мл ледяной уксусной кислоты, + 2,75 мл H2SO4 конц.), дистиллированная вода, водный раствор ДНК.

Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

Вначале необходимо построить калибровочный график. Для этого в 3 пробирки наливают по 1мл раствора ДНК с различной концентрацией (50, 100, 200 мкг/мл) и по 2 мл дифениламинового реактива. Помещают пробирки на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню для развития окраски, затем определяют оптическую плотность каждого из растворов при длине волны 595 нм. Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию использованных растворов ДНК, по оси ординат – соответствующие им значения оптической плотности.

Затем берут две пробирки: в контрольную пробирку наливают 1 мл воды, в опытную пробирку – 1 мл водного раствора ДНК (неизвестной концентрации). В каждую пробирку добавляют по 2 мл дифениламинового реактива. Обе пробирки помещают на 10 – 15 минут в кипящую водяную баню. Затем пробы охлаждают и измеряют насыщенность окраски против контроля при λ = 595 нм. Зная оптическую плотность пробы, по калибровочному графику находят количество ДНК в ней.

Состав проб

 

Про– бирки ДНК (мл) Дифенил– аминовый реактив (мл) H2O (мл)
50 (мкг/мл) 100 (мкг/мл) 200 (мкг/мл) Х (мкг/мл)
Х
К
10 – 15 мин кипящ. водян. баня
охладить, измерить оптич. плотность при λ=595 нм

 

 

Тема: ФЕРМЕНТЫ

Ферменты (от латинского fermentatio — брожение) можно определить как белки, которые благодаря своей способности к специфическому активированию молекул веществ, обладают каталитическими свойствами. Как всякое определение, это определение имеет ряд спорных моментов, например, под него не подходит такой каталитический белок, как цитохром С, так как является лишь переносчиком электронов.

Наука, изучающая ферменты, получила название энзимология (термин «энзим» ввел Кюне в1878 г.). Энзимология представляет важнейший раздел биохимии, т.к. сама жизнь представляет сложную совокупность химических реакций, катализируемых специфическими ферментами. Любые нарушения в функционировании ферментов в живой клетке могут повлечь серьезные изменения в организме.

Активация молекул субстрата в ходе ферментативной реакции происходит за счет образования специфического активированного комплекса фермент — субстрат, что сопровождается изменением энергии молекулы субстрата и способствует ее переходу в продукт.

Измерение скорости ферментативной реакции является важнейшим элементом методики исследования ферментов. Количество субстрата, прореагировавшего за определенный промежуток времени, может рассматриваться как показатель скорости реакции (при определенных условиях). При этом измеряют либо концентрацию расходующегося субстрата, либо образующегося продукта.

При работе с ферментами следует соблюдать ряд требований. Ферменты относительно неустойчивые соединения, нельзя допускать их инактивации. Общими требованиями является постоянство рН среды, температуры, соотношения концентраций фермента и субстрата.

Среди параметров, характеризующих свойства фермента, и определяемых экспериментальным путем следует выделить: структуру – аминокислотный состав, число пептидных цепей, наличие коферментов и т.д.; свойства –природа катализируемой реакции, субстратная специфичность, действие ингибиторов и активаторов; кинетические характеристики – удельная активность, диссоциация фермент-субстратного комплекса; термодинамические свойства – константы равновесия ферментативной реакции, величина свободной энергии, энтропии и энтальпии реакции, энергия активации комплекса фермент-субстрат, константа Михаэлиса; биологические свойства – значение фермента в обмене веществ, распространенность, внутриклеточная локализация, генетические мутации.

Наиболее общепринятым считают определение удельной активности фермента как «числа микромолей субстрата, превращаемых за 1 мин 1 мг фермента».

Особое значение имеет константа, характеризующая сродство фермента к субстрату. Зависимость скорости ферментативной реакции υ от концентрации субстрата S в подавляющем большинстве случаев описывается уравнением

υ =V S / S + КМ,

,где υ – скорость реакции при концентрации субстрата S, V — максимальная скорость реакции, достигаемая при концентрации субстрата, достаточно высокой для насыщения фермента, КМ – константа Михаэлиса.

В состав многих ферментов входят коферменты низкомолекулярные органические соединения, которые обусловливают активность ферментов и образуют с апоферментами диссоциирующие комплексы. Коферменты служат переносчиками химических групп, атомов водорода, электронов, в большинстве случаев представляют производные витаминов, например, пиридоксаль-5-фосфат, тиаминдифосфат, кофермент А.

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №1

Ферментативный гидролиз крахмала

Фермент амилаза, содержащийся в слюне, соке поджелудочной железы, крови, печени, мозге, катализирует гидролиз крахмала. Последовательно процесс расщепления крахмала можно представить следующим образом.

Реактивы: раствор слюны (свежую слюну разводят дистиллированной водой в 5 раз); 1 %-й раствор крахмала; раствор иода в иодиде калия (1 г KI растворяют в нескольких миллилитрах воды. В концентрированном растворе соли растворяют 1 г иода и разбавляют водой до 300 см3.); 5 %-й раствор гидроксида натрия; 5 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; водяная баня.

Ход работы

Задание 1. Гидролиз крахмала.

  1. В две пробирки налейте по 2 см3 1 %-го раствора крахмала.
  2. В одну пробирку долейте 1 см3 разведенной слюны, а в другую – 1 см3 воды (для контроля) и поставьте пробирки на 10 мин. в водяную баню или термостат, нагретые до 37 38 оС (внимательно следите за температурой, не допуская ее повышения).
  3. По окончании реакции проанализируйте содержимое пробирок на содержание крахмала и мальтозы, как указано в заданиях 2 и 3.

Задание 2. Обнаружение продуктов гидролиза крахмала.

  1. Из опытной и контрольной пробирок задания 1 отлейте в отдельные пробирки по 1 см3 растворов.
  2. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле раствора иода и перемешайте.
  3. Сравните окраску полученных растворов.

Задание 3. Обнаружение мальтозы.

  1. К оставшимся растворам опытной и контрольной пробирок добавьте по 1 капле раствора сульфата меди и по 5 капель раствора щелочи.
  2. Содержимое пробирок перемешайте и поместите их в кипящую водяную баню.
  3. Сравните окраску полученных растворов.

Оформление результатов.

Запишите схемы частичного и полного гидролиза крахмала. Объясните полученные результаты заданий 2 и 3.

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №2

Инактивация ферментов высокой температурой

Поскольку ферменты являются белками, они весьма чувствительны к температуре, при которой протекает реакция. Температурный оптимум действия ферментов теплокровных животных составляет 3738 оС. При небольшом повышении температуры скорость ферментативных реакций вначале повышается, но уже при дальнейшем нагревании (выше 50 оС) падает, а при 7080 оС утрачивается.

Реактивы: раствор слюны (cвежую слюну разводят водой в 5 раз); 1 %-й раствор крахмала; раствор иода в иодиде калия (см. работу №11); 5 %-й раствор гидроксида натрия; 5 %-й раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; водяная баня.

Ход работы

Задание 1

  1. В две пробирки налейте по 1 см3 разведенной слюны.
  2. Содержимое одной пробирки нагрейте до кипения и прокипятите 2-3 мин.
  3. Затем в обе пробирки добавьте по 1 см3 раствора крахмала и поставьте их на 10 мин. в водяную баню, нагретую до 38 оС.

Задание 2.

Из опытной и контрольной пробирок задания 1 отлейте в отдельные пробирки по 1 см3 их содержимого.

  1. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле раствора иода и тщательно перемешайте.
  2. Сравните окраску полученных растворов.

Задание 3. Обнаружение мальтозы.

  1. К оставшимся растворам опытной и контрольной пробирок добавьте по 1 капле раствора сульфата меди и по 5 капель раствора щелочи.
  2. Содержимое пробирок перемешайте и поместите их в кипящую водяную баню.
  3. Сравните окраску полученных растворов.

Оформление результатов

Объясните полученные результаты заданий 2 и 3. Сделайте вывод о влиянии температуры на активность ферментов.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №3









Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:


©2015- 2018 zdamsam.ru Размещенные материалы защищены законодательством РФ.