Методы изучения генетики человека

Человек, как вид имеет ряд особенностей, требующих для изучения его генетики разработки и применения специальных методик. К таким особенностям относятся: биосоциальная сущность человека, не разрешающая применение для изучения наследственности и изменчивости классического гибридологического метода генетического анализа; низкая плодовитость; редкая смена поколений, происходящая в среднем через 25-30 лет; наличие в геноме большого числа групп сцепления (23 у женщин и 24 у мужчин); полигенный характер наследования и невозможность стандартизации условий среды, в которых осуществляется экспрессия этих генов.

Человек, как объект генетических исследований, имеет и ряд преимуществ:

- большое количество особей в популяции людей;

- человек лучше других объектов изучен клинически;

- разработано много методов, позволяющих компенсировать вышеупомянутые трудности изучения.

Для изучения генетики человека разработаны и успешно используются следующие методы: клинико-генеалогический (метод родословных), популяционно-статистический, близнецовый, дерматоглифики и пальмоскопии, цитогенетический, молекулярно-цитогенетические: биохимические, молекулярно-генетические методы и метод генетики соматических клеток. На основании совокупности методов основана пренатальная диагностика наследственных заболеваний. На лабораторных занятиях подробно изучаются клинико-гениалогический, цитогенетический и популяционно-статистический методы, а также статистическое изучение модификационной изменчивости. Для формулировки научно обоснованных выводов необходимо использовать методы биометрии.

2. Каковы возможности и недостатки генеалогического метода.

4. Как провести генетический анализ родословной.

5. К каким типам наследования относятся наследственные признаки человека. Приведите примеры.

6. Как характеризуются родословные с разными типами наследования.

7. Объясните понятие пенетрантность и экспрессивность. Приведите примеры.

2) Представление на проверку родословной своей семьи и устная защита работы.

Теоретическая часть. Цитологический метод основан на микроскопическом изучении хромосом в клетках человека. Цитогенетический метод широко применяется с 1956 года, когда Дж. Тио и Л. Леван установили, что в кариотипе человека 46 хромосом.

Цитогенетический метод основывается на данных о хромосомах. В 1960 году на научной конференции в Денвере была принята классификация идентифицируемых хромосом, в соответствии с которой им были даны номера, увеличивающиеся по мере уменьшения размеров хромосом. Эта классификация была уточнена на конференции в Лондоне (1963) и Чикаго (1966).

Применение цитогенетического метода позволяет изучать нормальную морфологию хромосом и кариотипа в целом, определять генетический пол организма, и, главное, диагностировать различные хромосомные болезни, связанные с изменением числа хромосом или с нарушением структуры хромосом. Цитогенетический метод позволяет изучать процессы мутагенеза на уровне хромосом и кариотипа. Метод широко применяется в медико-генетическом консультировании для целей пренатальной диагностики хромосомных болезней.

В соматических клетках человека диплоидный набор хромосом, 2n=46, а в половых – гаплоидный n=23. При оплодотворении диплоидный набор хромосом восстанавливается.

В хромосоме выделяют короткое (р) и длинное (q) плечи. Концы обоих плеч хромосомы называют теломерами. В метафазе митоза хромосомы представлены двумя сестринскими хроматидами, соединенными центромерой. В центромере содержится вещество – кинетохор, участвующее в формировании нитей веретена при клеточном делении.

При изучении кариотипа определяют следующие морфометрические характеристики хромосом: L^а – абсолютная длина хромосомы в мкм; L^р – длина короткого плеча; L^g – длина длинного плеча. I^в – плечевой индекс, I^с – центромерный индекс, L^r – относительная длина хромосомы, I^h - процент гетерохроматиновой зоны, I^s – индекс спирализации.

По значению плечевого индекса определяется форма хромосом. При I^в 1-1,9 хромосома называется равноплечей (метацентрической), 2-4,9 – слабонеравноплечей (субметацентрической), 5 и более – акроцентрической или резко неравноплечей.

Для кариотипирования подбирают метафазные пластинки в количестве не менее 30 с одинаковым индексом спирализации.

На основании различий в длине выделены 23 пары хромосом. По форме в кариотипе человека имеются метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы. Отнесение хромосом к той или иной группе производится на основе расчета центромерного индекса. На основании размеров и комбинации плечевого и центромерного индексов хромосомы человека в соответствии с Международной Денверской классификацией (1960) сгруппированы в 7 групп, обохзначаемых буквами английского алфавита: A, B, C, D, E, F, G.

Таблица 1 Международная денверская классификация хромосом человека (1960г.)

В настоящее время для идентификации хромосом в соответствии с номенклатурой ISCN-1995 (парижская номенклатура) все чаще используется дифференциальное окрашивание, которое на хромосомах дает полосы поперечной исчерченности, благодаря которым можно более точно идентифицировать пары гомологов.

Анализ кариотипа проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток. Наиболее часто используют культуру клеток переферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Для анализа кариотипа плода используют различные клеточные культуры; их выбор определяется сроком беременности (до 12 недель – используют клетки ворсин хориона, в более поздние сроки – клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты).

Цитологический анализ включает три основынх этапа:

Культивирование. Образец помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений – фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Для увеличения числа метафазных клеток (кариотип изучают в метафазных клетках, где хромосомы достигают наибольшей спирализации и наиболее четко проявляется их форма) за 1,5 часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин (C₂₂H₂₅NO₆), который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии метафазы и увеличивает конденсацию (спирализацию) хромосом. Обычно культивирование составляет 72 часа. После этого клетки отделяют центрифугированием и помещением в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. В гипотонической среде происходит разрыв ядерной оболочки и межхромосомных связей и хромосомы свободно перемещаются в цитоплазму. Затем производится фиксация клеток в фиксаторе Карнуа (3:1): 3 части составляет 96% этиловый спирт ректификат, 1 часть ледяная уксусная кислота.

После фиксации клеточную суспензию раскладывают на обезжиренные, охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе.

Окраска. Наиболее простой метод окраски хромосом – это сплошная по Гимза. Сплошная окраска применяется для определения количества хромосом, выявления геномных мутаций и анеуплоидии.

Для выявления структурной перестройки хромосом (хромосомные мутации) используют дифференциальную окраску, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и длина темных и светлых полос строго индивидуальна для каждой хромосомы, благодаря этому можно провести более точную идентификацию гомологичных пар и выявить перестройки хромосом.

Наиболее эффективен G-метод дифференциального окрашивания, для этого можно использовать краситель Гимзы, после предварительной обработки хромосом раствором трипсина. При таком окрашивании количество полос на хромосомах в метафазных пластинках достигает 400. Для дифокраски используют также R-метод, и Q-метод. После окраски объект заключают в Канадский бальзам, препарат становится постоянным и может храниться десятки лет.

Микроскопирование препаратов метафазных хромосом. Для описания кариотипа человека используется универсальная схема и специальные символы. Например, запись 46,хх – обозначает нормальный кариотип женщины, а 46, ху – нормальный кариотип мужчины.

В ряде случаев при изучении хромосом обнаруживают полиморфизм, который наиболее характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников, спутничных нитей в области коротких плеч и их величину. В таблице 2 приведены некоторые из них.

Таблица 2 Обозначение полиморфизма хромосом человека

Установлено, что наличие нормального полиморфизма хромосом увеличивает риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями.

Среди супружеских пар, у которых наблюдалось рождение детей с пороками развития, а также страдающих бесплодием и привычным невынашиванием беременности, чаще выявляется носительство хромосом с крупными гетерохроматиновыми блоками. Преобладание лиц с увеличенными гетерохроматиновыми сегментами в акроцентрических хромосомах, а также в хромосомах 1, 9 и 16 отмечено в группе детей с множественными врожденными пороками развития.

Следуя рекомендациям IV Международного конгресса по генетике человека в Париже (1971), при описании добавочных хромосом их номер помещают после общего числа аутосом и половых хромосом со знаком «плюс» или «минус» перед номером вовлеченной аутосомы. Например, запись (формула) 47,ХХ+21 обозначает кариотип женщины с трисомией по 21 паре хромосом. Напротив, кариотип мужчины с экстрахромосомой Х изображают как 47,ХХY. Знак «плюс» или «минус» ставят после символа хромосомы, чтобы указать удлинение или укорочение ее плеча. Буква q символизирует длинное плечо, а p – короткое. Например, запись 46,ХY,1q+ указывает на увеличение длинного плеча хромосомы 1. Формула 47,ХY+14р+ - кариотип мужчины с 47 хромосомами, включая и дополнительную хромосому 14 с удлинением ее короткого плеча.

Сокращение – def (дефишенс), dup (дупликация), r (кольцо, возникающее после воссоединения двух разрывов в хромосоме), inv (инверсия) и t (транслокация) – обозначают аберрации хромосом. Номера хромосомы или хромосом помещают после сокращений в скобках. Например, запись 46,ХХ,r(18) означает кариотип женщины с 46 хромосомами, включая r-хромосому 18. Формула 46,Х,inv(Хq) – кариотип женщины с 46 хромосомами, включая одну нормальную Х-хромосому и изохромосому Х (с двумя генетически идентичными длинными плечами). Банды помечаются числами по мере удаления от центромеры вдоль короткого (р) и длинного (q) плечей хромосомы.

С помощью цитогенетического метода выявлены хромосомные мутации типа реципрокных транслокаций, робертсоновских транслокаций и делеций. Так, транслокация 21-й хромосомы на другую 21, 22, 13, 14 или 15 вызывает синдром Дауна. Так, делеция короткого плеча Х-хромосомы (трактуется как моносомия по Х-хромосоме) укорочение короткого плеча 21-й хромосомы (филадельфийская хромосома), делеция короткого плеча хромосомы 5-й пары (синдром «кошачьего крика»), делеция длинного и короткого плеча 18-й хромосомы (нарушение строения лица, скелета, умственная отсталость, гипотрофия, гипотония и многие другие аномалии). В результате двух концевых нехваток образуются кольцевые хромосомы. При кольцевой 5-й хромосоме развивается синдром «кошачьего крика», в х-хромосоме – клиническая картина близка синдрому Шерешевского-Тернера. Среди геномных мутаций наиболее часто встречается синдром Дауна (трисомия по 21 паре). Трисомия по 13 хромосоме вызывает синдром Патау, по 18 хромосоме – синдром Эдвардса. Среди анеуплоидных синдромов по половым хромосомам (ХО) – синдром Шершевского-Тернера. Полисомия по Х хромосоме называется синдром Клайнфельтера (ХХY), встречаются отклонения по числу половых хромосом (ХХХY, XYY и др.) и синдром ТриплоХ.

Метод определения полового хроматина. Это экспресс метод, позволяющий выявить изменения числа половых хромосом в неделящихся клетках слизистой оболочки щеки. Половой хроматин, или тельце Барра, образуется одной из хромосом женского организма. Оно выглядит как интенсивно окрашенная глыбка, расположенная вблизи ядерной оболочки. При увеличении количества Х-хромосом в кариотипе организма образуются тельца Барра в количестве на единицу меньше числа Х-хромосом. При моносомии по Х-хромосоме тельце Барра отсутствует. Y-хромосома в мужском кариотипе обнаруживается по более интенсивной люминисценции при обработке акрихинипритом и излучении в ультрафиолетовом свете.

Изучите конспект лекции и материал учебников.

Запишите в словарь и выучите основные термины и понятия: хромосома, плечо хромосомы, центромер (кинетохор), различия хромосом по форме (метацентрическая, субметацентрическая, акроцентрическая), проксимальный, дистальный и теломерный участок плеча, вторичная перетяжка, спутник, спутничные хромосомы, SAT-хромосомы, дизоксирибонуклеопротеиды (ДНП): эухроматин, гетерохроматин, метафазная пластинка. Кариотип, гомологичные хромосомы, изохромосомы, кариограмма, идиограмма, морфометрические параметры (абсолютная длина хромосомы, плечевой индекс, центромерный индекс, относительная длина, процент гетерохроматиновой зоны, индекс спирализации, нуклеосома, нуклеосомная нить, элементарная хроматиновая фибрилла, интерфазная хромонема, метафазная хроматида, политенная хромосома, хромосома типа ламповых щеток, гаплоидный набор хромосом, диплоидный набор хромосом, половые хромосомы, аутосомы, В-хромасомы.

Зарисуйте строение метафазной хромосомы, спутничной хромосомы, политенной хромосомы, хромосомы типа ламповых щеток.

Подсчитайте число хромосом на метафазной пластинке. Постройте идиограмму (по заданию преподавателя) на основании унифицированной номенклатуры..

Измерьте абсолютную длину и плечи хромосом (в мм) и данные занесите в Таблицу 3.

Число строк в таблице должно соответствовать числу хромосом изучаемого кариотипа.

Вычислите индекс спирализации I^s и значения морфометрических показателей L^a, I^r, I^b, I^c^,I^h и занесите их в таблицу 2.

Абсолютная длина самой хорошо заметной хромосомы (ее называют тестерная) хромосомы измеряется при микроскопировании, с помощью окуляр-микрометра и выражается в мкм. Затем вычисляется коэффициент увеличения хромосом на фотографии метафазной пластинки, а затем – через коэффициент увеличения – вычисляется абсолютная длина каждой хромосомы кариотипа. Например, длина тестерной хромосомы L^a1.1 на фотографии равна 27 мм, или 27×1000мкм, физическая или абсолютная длина этой же хромосомы L^a1.1 составляет 10,5 мкм, тогда коэффициент увеличения

В нашем примере

. Далее, например L^a’1.2=26,5 мм.

. L^a, выраженную в мкм, заносим в таблицу 4.

;

. I^sвычисляется как отношение суммы абсолютной длины 2-х самых коротких хромосом к сумме абсолютной длины 2-х самых длинных хромосом.

Основные морфометрические параметры хромосом

Число строк в таблице должно соответствовать числу хромосом изучаемого кариотипа.

Проанализируйте данные идиограмм и таблиц используя представления о морфологическом подобии гомологичных хромосом и их числе в кариотипе.

Сделайте вывод по результатам выполненной работы.

1. Раскройте понятия кариотип, кариограмма, идиограмма.

2. Каковы химический состав, строение и морфология хромосом.

3. В чем заключается содержание цитогенетического метода, каковы его возможности.

4. Какое значение имеет дифокраска хромосом.

5. Опишите степени упаковки ДНК в метафазную хромосому (нуклеосома, нуклеосомная нить, хромонема).

7. Приведите примеры хромосомных и геномных мутаций у человека.

В нормальном кариотипе человека присутствуют 44 аутосомы и 2 половые хромосомы (ХХ либо ХY). В случае истинного гермафродизма (одновременно мужские и женские половые железы у индивидуума) в организме обнаруживают два клона клеток, отличающихся по составу половых хромосом (XX/XY).

а) Сделайте символическую запись нормального кариотипа женщины и мужчины.

б) Сделайте запись кариотипа человека с истинным гермафродитизмом.

Сделайте расшифровку кариотипов больных людей: 1) 47, XY,+G; 2) 46,XX,1p+; 3) 46,XY,14q-; 4) 47,XX,+14p+; 5) 46,XX,del(1)(q21); 6) 46,XY,t(2;5)(q21;q31); 7) 46,XX,r(18). Примечание: del – делеция, t – транслокация, r – кольцевая хромосома.

Сколько телец полового хроматина можно обнаружить в большинстве интерфазных клеток людей с кариотипами: 1)46,XX; 2)46,XY; 3)47,XXY; 4) 48,XXXY; 5) 45,X; 6)47,XXX; 7)48,XXXX; 8)49,XXXXX?

- представление на проверку оформленной тетради и устная защита работы;

- выполнение проверочного теста. Работа по изучению кариотипа должна быть оформлена как отдельное задание.

Таблица 5. Число генотипов и частота аллелей в модельной популяции

Во втором варианте следует выполнять работу до тех пор, пока число генотипов не будет повторяться, что свидетельствует об установлении в популяции нового равновесного состояния.

При записи генотипов могут вкрадываться как случайные ошибки, так и отражаться закономерное изменение числа генотипа. Поэтому необходимо вычислить критерий χ² – критерий соответствия практически полученных данных теоретически ожидаемому.

Для этого определим теоретически ожидаемую частоту генотипов для заданного соотношения гамет. Например, если исходные гаметы: кружки А – 30, а –70; то по таблице Пеннета:

В этой таблице 0,09 АА – соответствует 9 генотипам АА из 100, 0,42 Аа – соответствует 42 генотипам Аа из 100, 0,49 аа – соответствует 49 генотипам аа из 100 полученных в опыте.

χ²_факт.= Σd²/q =9:9+36:42+9:49=1 + 0,85 + 0,18 = 2,03; при n' =2, при P =0,05

Сравнив методом χ² полученные результаты с теоретически ожидаемыми делаем вывод, что в данном случае полученное отношение не отличается от ожидаемого, так как χ²_факт.< χ2 табличное 5,99. Следовательно, в I варианте в панмиксной популяции сохраняются первоначальные частоты аллелей (рА – 03 и qa – 0,3). Аналогичную работу проведите для I и II вариантов. Сделайте выводы.

1. Болезнь Тея-Сакса обусловлена аутосомным рецессивным аллелем. Характерные признаки этой болезни – отставание в умственном развитии и слепота, смерть наступает в возрасте около четырех лет. Частота заболевание среди новорожденных около десяти на 1 млн. Исходя из равновесия Харди-Вайнберга, рассчитайте частоты аллелей и гетерозигот.

2. Кистозный фиброз поджелудочной ткани (муковисцидоз) – наследственная болезнь, обусловленная рецессивным аллелем; характеризуется плохим всасыванием в кишечнике и абструктивными изменениями в легких и других органах. Смерть наступает обычно в возрасте около 20 лет. Среди новорожденных кистозный фиброз случается в среднем у 4 на 10000. Исходя из равновесия Харди–Вайнберга, рассчитайте частоты всех трех генотипов у новорожденных, какой процент составляют гетерозиготные носители.

3. Акаталазия – заболевание, вызываемое рецессивным геном, впервые было обнаружено в Японии. У гетерозигот по этому гену наблюдается пониженное содержание каталазы в крови. Частота гетерозигот составляет 0,09% среди население Хиросимы и Нагасаки; и 1,4% среди остального населения Японии. Исходя из равновесия Гарди–Вайнберга, рассчитайте частоты аллелей и генотипов:

Задача 4. В таблице приведена частота аллелей, контролирующих группы крови системы АВ0, среди людей из 4 обследованных популяций. Определите частоту различных генотипов в каждой из указанных популяций.

Таблица 6. Частота аллелей, определяющих группы крови АВ0

5. В таблице приведена частота (в процентах) групп крови 0, А, В и АВ в 4 различных популяциях. Определите частоту соответствующих аллелей и разных генотипов в каждой из этих популяций.

1. Объясните, что нужно понимать под генетической и генотипической структурой популяции.

2. Какому закону подчиняется генетическая структура популяции, в чем его сущность.

3. Охарактеризуйте факторы динамических процессов в популяции.

5. Почему в близкородственных браках чаще проявляются наследственные заболевания?

6. В каких генотипах содержатся рецессивные аллели в популяциях.

- предоставление на проверку рабочей тетради;

- решение задач на определение генетической структуры популяции с использованием Закона Харди-Вайнберга;

Метод предложен в 1875г. Гальтоном первоначально для оценки роли наследственности и среды в развитии психических свойств человека. В настоящее время метод широко применяется в изучении наследственности и изменчивости человека для определения соотносительной роли наследственности и среды в формировании различных признаков.

С помощью близнецового метода можно выявить наследственный характер признака, определить пенетрантность аллеля, оценить эффективность действия на организм некоторых внешних факторов (лекарственных препаратов, обучения, воспитания).

Сущность метода заключается в сравнении проявления признака в разных группах близнецов при учете сходства или различия их генотипов. Монозиготные близнецы (МБ) генетически идентичны, т.к. развиваются из одной зиготы, поэтому среди монозиготных близнецов наблюдается высокий процент конкордантных пар, в которых признак развивается у обоих близнецов, что свидетельствует о генетической обусловленности признака. По признакам, в формировании которых ведущая роль принадлежит факторам среды между близнецами наблюдается несовпадение или дискордантность. Количественную оценку относительной роли наследственности и среды можно сделать на основе расчета коэффициента наследственности Н и коэффициента влияния среды Е. с помощью формулы К. Хольцингера: Н=(КМБ-КДБ)/(100-КДБ), где КМБ – конкорданность признака (в %) для МБ; КДБ – то же для ДБ. Если Н=1, т.е. 100%, то можно считать, что экспрессия признака определяется только генотипом индивидуума. Если Н=70%, то 70% - в формировании признака отводится наследственности, а 30% - факторам среды.

Существуют таблицы конкордантности близнецов по различным признакам и заболеваниям.

Таблица 8. Конкордантность (в процентах) нормальных признаков человека, установленная при исследовании пар МБ и ДБ

Трудности близнецового метода связаны с низкой рождаемостью близнецов в популяциях (1:86 – 1:88), с идентификацией монозиготности близнецов, что важно для достоверности выводов.

Для идентификации монозиготности применяют полисимптомный метод сравнения близнецов по многим признакам, методы основанные на иммунологической идентичности близнецов по эритроцитарным антигенам (АВ0, МN, резусу), по сывороточным белкам, g-глобулину), наиболее достоверный критерий – трансплпнтационный тест с применением перекрестной пересадки кожи.

Задача 1. В таблице «Конкордантность (в процентах) нормальных признаков человека, установленная при исследовании пар МБ и ДБ» приведены данные о конкордантности некоторых нормальных признаков у пар МБ и ДБ.

Проанализируйте приведенные результаты и сделайте предварительное заключение об относительной роли наследственности и факторов среды в развитии каждого из указанных признаков.

Для уточнения сделанного заключения проведите расчеты коэффициентов наследственности (Н) и влияния среды (Е), используя формулу Хольцингера.

Задача 2. Роанализировав результаты изучения пар близнецов, приведенные в таблице рассчитайте коэффициенты Н и Е с помощью формулы Хольцингера и сделайте заключение об относительной роли наследственности и факторов среды в развитии указанных заболеваний человека.

Таблица 9. Встречаемость некоторых заболеваний среди пар МБ и ДБ

Задача 3. Проанализируйте результаты наблюдений за близнецами, приведенные в таблице и сделайте заключение об относительной роли наследственности и факторов среды в развитии указанных инфекционных заболеваний (в некоторых случаях можно использовать формулу Хольцингера)

Таблица 10. Встречаемость некоторых инфекционных заболеваний у близнецов

Человек, как объект генетических исследований, имеет и ряд преимуществ:

- большое количество особей в популяции людей;

- человек лучше других объектов изучен клинически;

- разработано много методов, позволяющих компенсировать вышеупомянутые трудности изучения.

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: