Вплив концентрації субстрату на швидкість

Залежність початкової швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату показує, що при низьких концентраціях субстрату спостерігається виразна залежність між його концентрацією і швидкістю реакції. При надлишку субстрату швидкість реакції постійна і називається максимальною швидкістю.

Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату (крива Михаеліса-Ментен) ілюструє рисунок 1.1.

V (швидкість реакції) Насиченість активних центрів

Рис. 1.1. Залежність швидкості ферментативної реакції від

Математичний аналіз кривої, зображеної на рисунку, показав, що фермент і субстрат при взаємодії утворюють фермент-субстратний комплекс за схемою:

де P – продукт реакції; Е – фермент; S – субстрат; ES – фермент-субстратний комплекс; k – константа швидкості.

З трьох реакцій, наведених на схемі (константи швидкості k₁, k_-1, k₂) сама повільна – це реакція розпаду фермент-субстратного комплексу з утворенням продукту (Р). Сумарна швидкість ферментативної реакції визначається концентрацією фермент-субстратного комплексу. За законом діючих мас висока концентрація субстрату зрушує рівновагу убік фермент-субстратного комплексу аж до такого стану, коли всі молекули ферменту виявляться зв'язані із субстратом у комплекс ES. Коли це відбудеться, подальше підвищення концентрації субстрату вже не збільшує концентрацію комплексу ES і, отже, не збільшує швидкості реакції.

Тому зі збільшенням концентрації субстрату швидкість ферментативної реакції зростає тільки до певного значення (максимальна швидкість Vmax), обумовленого всією кількістю ферменту, зв'язаного в комплекс.

Залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату описується рівнянням Холдейна-Бриггса (удосконалене класичне рівняння Михаеліса-Ментен) (1.4):

Константа Михаеліса Кm має дуже велике значення в ензимології та є важливою характеристикою даного ферменту. Константу Михаеліса надають у молях на літр. Якщо v = 1/2 V, то [ S ] = Km. Отже, константа Михаеліса дорівнює тій концентрації субстрату (вираженої в моль на л), при якій спостерігається швидкість реакції, рівній половині максимальної. Константа Михаеліса характеризує спорідненість ферменту до субстрату: чим більша ця величина, тим більша спорідненість, і навпаки.

При виділенні нового ферменту дуже важливо знати константу Михаеліса. Її потрібно визначати за можливістю в найбільш чистому ферментному препараті. Разом з тим її варто визначати при строго постійних умовах (t°, pН і т.п.) і за можливістю за самий короткий початковий період реакції.

Рівняння Михаеліса-Ментен, оброблене за методом подвійних зворотних величин Лайнуівера-Берка, має наступний вид (1.5):

Цей вираз аналогічний вираженню в = ах + b, тобто рівнянню прямої лінії. Графічний спосіб знаходження константи Міхаеліса по методу подвійних зворотних величин широко застосовується в даний час у ензимології.

Графічно константа Михаеліса може бути надана так, як це показано на рисунку 1.2.

Рис. 1.2. Залежність швидкості реакції від концентрації субстрату

Тема: протеолітична активність. Вплив концентрації субстрату на швидкість ферментативної реакції.

Мета роботи: визначити протеолітичну активність культуральної рідини одного з представників p. Aspergillius. Дослідити залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату (білка).

Матеріали та устаткування: культуральна рідина, піпетки місткістю 1 та 2 мл, пробірки, фільтри, лійки, термостат (37°С), ФЕК, кювети товщиною 10 мм.

Реактиви: казеїн, 2%-ний розчин, фосфатний буфер, 0,1 М розчин (рН 8,0), ТХО, 5%-ний розчин, NaOH, 1%-ний розчин, реактив Фоліна.

Фенольний реактив (Фоліна). У круглодонну колбу на 1,5-2 л вносять 100 г вольфрамату натрію NaWO₄ 2H₂O і 25 г молібдату натрію Na₂МоО₄ 2Н₂О та розчиняють їх у 700 мл дистильованої води. До розчину додають 50 мл 80%-ного розчину фосфорної кислоти і 100 мл концентрованої соляної кислоти.

До колби приєднують зворотний холодильник і кип'ятять протягом 10 годин. Потім додають 150 г сульфату літію, 50 мл води та 3-4 краплі брому. Кип'ятять без холодильника 15 хв для видалення надлишку брому. Потім розчин охолоджують до кімнатної температури, доводять його об’єм до 1 л водою та фільтрують. Отриманий розчин повинний бути яскраво-жовтого кольору. Його зберігають у темній склянці і перед вживанням розбавляють дистильованою водою 1:1.

Для готування 2%-ного розчину казеїну 2 г речовини поміщають у мірну колбу і заливають невеликою кількістю 1%-ного розчину гідроксиду натрію. Після набрякання додають буферний розчин і поміщають на водяну баню до повного розчинення. Після охолодження розчин доводять буфером до об’єму 100 мл, рН розчину повинний бути 8,4.

Ферменти займають особливе місце серед різноманітних продуктів мікробного синтезу. Активними продуцентами ферментів є різні мікроорганізми: дріжджі, гриби, бактерії, актіноміцети. Широко використовуються в народному господарстві протеолітичні, амілолітичні, целюлолітичні та бактеріолітичні ферменти. Активними продуцентами цих ферментів є представники аспергіл, актиноміцетів, бацил.

Протеази каталізують гідролітичне розщеплення білкових речовин. Протеолітичну активність мікроорганізмів, зокрема актиноміцетів, дуже часто визначають за збільшенням кількості амінних та карбоксильних груп у амінокислот чи пептидів, що утворяться в результаті руйнування субстрату, або за наявністю в продуктах гідролізу тих чи інших вільних амінокислот. Як субстрат, при визначенні протеолітичної активності мікроорганізмів, використовують білки тваринного походження - казеїн, гемоглобін, желатин, колаген, кератин, яєчний та сироватковий альбуміни та ін. З огляду на фізіологічні особливості досліджуваного об'єкта, звичайно вибирають найбільш оптимальні умови для проявлення протеолітичної активності, а саме: склад середовища, вік культури, температуру, аерацію та ін. Надалі ретельно підбирають склад реакційної суміші (кількість випробовуваного матеріалу і субстрату, якість буферного розчину і його рН), час гідролізу і температуру.

Роботу можна проводити з музейним штамом Asp. niger, здатним утворювати позаклітинні протеази. Культуру підтримують на середовищі наступного складу (г/л): сахароза - 10; КNО₃ - 1,0; КН₂РО₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,5; NaCl - 0,5; CaCO₃ - 5,0; агар-агар - 20; вода водопровідна.

Середовище для вирощування посівного матеріалу містить (г/л); кукурудзяний екстракт (сирий) - 40; лактозу - 20; водопровідну воду.

Середовища готують на водопроводній воді і стерилізують при 0,5 атм.

Посівний матеріал. Конідії гриба змивають з агаризованого середовища в пробірку з 8-10 мл стерильної води. Отриману суспензію конідій переносять у колбу з 100 мл рідкого посівного середовища, останню поміщають на качалку. Посівним матеріалом служить 48-годинна культура гриба.

Умови культивування. У 2 качалочні колби наливають по 100 мл ферментаційного середовища. У кожну колбу вносять по 4 мл посівного матеріалу. Гриб культивують на качалці при t =28-30°С 5-7 діб. Щодоби з однієї колби стерильно відбирають проби по 10 мл, у яких визначають: рН культуральної рідини на потенціометрі; біомасу за вагою сухого міцелію; протеолітичну активність колориметричним методом Ансона. Наприкінці досліду проводять виділення і первинний аналіз сирцю, що містить протеолітичний фермент.

При відсутності музейних культур можна використовувати ґрунтові актиноміцети. Актиноміцети вирощують в умовах глибинного культивування на протязі 5 діб при температурі 28°С на середовищі наступного складу (г/л): К2НРО₄ - 0,5; MgSО₄ - 0,5; NaCl - 0,5; пептон - 0,8; глюкоза - 20,0; СаСО₃ - 1,0.

ІІ. Визнання активності протеаз фотоколориметричним методом Ансона. Побудова каліброваної кривої за стандартними розчинами тирозину (чи триптофану)

Метод заснований на утворенні інтенсивно-синього забарвлення реактиву Фоліна з продуктами гідролізу казеїну, що неосаджуються трихлороцтовою кислотою (ТХО), в тому числі з тирозином і триптофаном. Тому стандартну криву будують за розчином одного з цих сполук.

Для роботи будують калібровану криву. Для цього 25 мг тирозину (чи триптофану), зважених на аналітичних вагах, розчиняють у 5 мл 0,1 н. NaOH, переносять у мірну колбу на 50 мл та доводять дистильованою водою до мітки. З вихідного розчину, що містить 500 мкг тирозину в 1 мл, готують розчини тирозину, що містять 10, 20, 30, 40, 50 мкг у мл. З цих розчинів беруть по 1 мл у чисті сухі пробірки, додають 4 мл 6%-ного розчину карбонату натрію та 1 мл реактиву Фоліна (розведеного в 5 разів), вміст пробірок перемішують та залишають до розвитку забарвлення на 30 хв при кімнатній температурі. Одночасно ставлять 2 пробірки для контролю на реактиви, замість розчину тирозину використовують воду.

Інтенсивність забарвлення досліджуваних розчинів вимірюють на ФЕКі проти контрольного розчину при 656-677 нм (червоний світлофільтр) з довжиною світлового шляху 10 мм. Результати вносять у таблицю. Будують калібрований графік вмісту тирозину, відкладаючи на осі ординат оптичну щільність досліджуваних розчинів, на осі абсцис – вміст тирозину_.

III. Визначення протеолітичної активності культуральної рідини. Вплив концентрації субстрату на швидкість ферментативної реакції, яка каталізується протеазами

1. Культуральну рідину відокремлюють від клітин фільтруванням через паперовий фільтр.

У п'ятьох пробірках готують інкубаційні суміші, як показано у таблиці 2.1:

Таблиця 2.1. - Варіанти приготування інкубаційних сумішей

Проби ретельно перемішують і витримують у термостаті при 37°С протягом 30 хв. Реакцію зупиняють додаванням 5 мл розчину ТХО. Проби перемішують і фільтрують.

Паралельно для визначення величини виправлення на тирозин, що міститься в культуральній рідині та у розчині казеїну, роблять контрольне визначення: до 2 мл культуральної рідини додають 5 мл ТХО і тільки потім розчин казеїну. Вміст без прогрівання перемішують, фільтрують і з фільтрату беруть 1 мл для визначення тирозину, що утворився за 30 хв із казеїну під впливом протеолітичних ферментів культуральної рідини.

У дві пробірки наливають по 4 мл 1%-ного розчину NaOH, потім в одну з них наливають 1 мл отриманого фільтрату контрольної проби, в другу - 1 мл фільтрату дослідної проби, в обидві пробірки додають 1 мл реактиву Фоліна, перемішують. З'являється синє забарвлення; залишають для розвитку забарвлення на 30 хв при кімнатній температурі. Інтенсивність забарвлення визначають на ФЕКі при довжині хвилі 670 нм, у кюветах з відстанню 10 мм.

При високій протеолітичній активності (зашкалення ФЕКу) потрібно розбавити фільтрати культуральної рідини в залежності від інтенсивності забарвлення.

Потім за різницею між оптичною щільністю дослідної і контрольної проб, використовуючи калібрований графік, визначають приріст тирозину в розчині в результаті ферментативного гідролізу казеїну.

За одиницю протеолітичної («казеїназної») активності приймають кількість ферменту, що каталізує за одну хвилину при t = 37°С відщеплення від казеїну 1 мікромоль тирозину (181 мкг).

Тоді число протеолітичних одиниць (ПЕ) досліджуваної культуральної рідини (у моль^-3/мл  хв) розраховується за формулою (2.1):

де а – тирозин у досліджуванім розчині (мкг);

б – тирозин (мкг), що міститься в культуральній рідини і казеїні (виправлення на тирозин);

8 – множник для перерахування кількості тирозину на весь об’єм фільтрату, отриманого після осадження ТХО;

181 – молекулярна вага тирозину (чи триптофану = 204), мкг;

Отримані результати оформляють у вигляді звіту.

Записують принцип методу, отримані на ФЕКі значення оптичної щільності, концентрацію тирозину, знайдену за графіком, і розрахунок активності.

Будують графік залежності швидкості реакції від концентрації субстрату.

Пояснюють характер отриманої кривої. Якщо в досліді досягнута максимальна швидкість реакції, то можна розрахувати величину Km за графіком. Однак, значення Km, визначене таким шляхом, є далеко не точним. Для точного обчислення необхідно надати експериментальні дані таким чином, щоб графік був лінійним. Для цього відкладають на осі ординат відношення 1/V, а на осі абсцис 1/[S].

Рівняння Михаеліса-Ментен, оброблене за методом подвійних зворотних величин Лайнуівера-Берка, має наступний вигляд:

Виходить пряма лінія. Продовживши пряму до перетинання з віссю абсцис, знаходять величину 1/Km.

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: