Сдам Сам

ПОЛЕЗНОЕ


КАТЕГОРИИ







Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену





Метод Грама (Gram). Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при обработке спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.

Таблица 4. Метод Грама

Этапы окраски Цвет бактерий
1. На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет  
2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту Все бактерии остаются фиолетовыми  
3. Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт в течение 3-6 с, промыть водой Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются
4. Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) на 1-2 мин, промыть водой, высушить Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет

Метод Циля-Нильсена.Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.

Таблица 5. Метод Циля-Нильсена

Этапы окраски Цвет бактерий
1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть препарат в пламени горелки до появления паров (повторить 3-4 раза) Все бактерии окрашиваются в красный цвет  
2. Снять бумагу, промыть мазок водой Все бактерии остаются красными  
3. Для дифференцирования нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 минуты Кислотоустойчивые бактерии остаются красными, некислотоустойчивые обесцвечиваются
4. Нанести водный раствор метиленового синего и докрасить 3-5 мин, промыть водой, высушить Кислотоустойчивые остаются красными, некислотоустойчивые окрашиваются в синий цвет

Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовая и фтиоловая кислоты, воск D, глико- и фосфолипидовы), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.tuberculosis, M.bovis, M.leprae и др.)



 

Занятие № 2

ТЕМА: Специальные методы окраски. Устройство биологического микроскопа. Виды микроскопии. Порядок проведения иммерсионной микроскопии.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать различные методы окраски, используемые для выявления структур бактериальной клетки (спор, капсул, включений) и отдельных групп микроорганизмов; устройство биологического микроскопа и правила работы с ним; виды микроскопии (фазово-контрастная, люминесцентная, темнопольная, электронная); порядок проведения микроскопии с масляной иммерсией.

уметь выявлять наличие капсул у бактерий в препаратах, окрашенных методом Бурри-Гинса; выявлять наличие спор у бактерий в препаратах, окрашенных методом Ожешко; готовить препараты “раздавленной” и “висячей” капли из грибов и бактерий; определять подвижность у бактерий; определять включения бактерий (зерна волютина) в препаратах, окрашенных методом Леффлера; проводить микроскопию с масляной иммерсией.

1. Вопросы для самоподготовки:

1. Специальные методы окраски для выявления отдельных структур бактериальной клетки (Бурри-Гинса, Ожешко, Леффлера и др.)

2. Методы окраски отдельных групп про- и эукариот

3. Изучение подвижности микроорганизмов

4. Виды микроскопии (фазово-контрастная, люминесцентная, темнопольная, электронная)

5. Устройство биологического микроскопа

6. Порядок проведения иммерсионной микроскопии

2. Контрольные вопросы

1) Перечислить основные части биологического микроскопа ___________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2) Выписать какие структуры или свойства микробов определяются при следующих методиках окрасок:

по Граму - _________________________; по Цилю-Нильсену - ________________________;

по Ожешко - _______________________; по Бурри-Гинсу - __________________________;

при микроскопии в тёмном поле препаратов «раздавленная капля» и «висячая капля» - ________________________________________________________________________________

3) Выписать порядок проведения иммерсионной микроскопии:

1. ______________________________________________________________________________

2. ______________________________________________________________________________

3. ______________________________________________________________________________

4. ______________________________________________________________________________

5. ______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

6. ______________________________________________________________________________

7. ______________________________________________________________________________

8. ______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

9. ______________________________________________________________________________

10. _____________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________ББазовый текст

Специальные методы окраски для выявления отдельных структур бактерий

Метод Бури-Гинса.Относится к сложным методам окраски и используется для выявления капсулы бактериальной клетки. Этапы окраски:

1. На предметном стекле смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши, разведенной 1:10 и при помощи стекла со шлифованным краем сделать мазок таким же образом, как мазок крови, высушить и осторожно фиксировать в пламени горелки или горящим на мазке спиртом.

2. Нанести на мазок водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3. Промыть водой, высушить на воздухе.

Метод Бурри-Гинса относится к негативным методам окраски: на первом этапе тушь, обтекая капсульные бактерии, создает черный или коричневый фон (соответствующий цвету туши) на котором хорошо видны неокрашенные бактерии, которые на втором этапе окрашиваются в красный цвет, а капсула остается бесцветной. Таким образом, капсулы бактерий хорошо видны на темном фоне туши виде неокрашенных зон вокруг красных бактерий.

Метод Ожешко (Ауэски). Относится к сложным методам окраски и используется для выявления спор бактерий. Этапы окраски:

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлористоводородной кислоты (HCl) и подогреть в течение 2-3 мин на пламени (для протравливания плотной оболочки споры) до полного испарения кислоты.

2. Окрасить по методу Циля-Нильсена.

Споры бактерий будут окрашиваться в красный цвет (как кислотоустойчивые бактерии), а вегетативные формы в синий цвет (как некислотоустойчивые бактерии).

Метод Леффлера. Относится к простым методам окраски и используется для выявления зерен волютина (цитоплазматических включений полифосфатов) у возбудителя дифтерии (C.diphtheriae), у которого эти включения располагаются по полюсам клетки. Фиксированный мазок окрашивают уксусно-кислым метиленовым синим в течение 3-5 минут. Зерна волютина обладают свойством метахромазии и более интенсивно накапливают краситель – цитоплазма бактерий окрашена в голубой цвет, зерна волютина – в темно-синиий.









Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:


©2015- 2018 zdamsam.ru Размещенные материалы защищены законодательством РФ.