Глава 2 Методы разделения клеток периферической крови человека

Для изучения функциональной активности лимфоцитов и других клеток крови необходимы эффективные способы их разделения (рис. 2.1). Идеальные методы разделения характеризуются незначительной степенью потерь клеток при высокой степени очистки, сохранением физиологической активности выделенных клеток. В основе методов выделения клеток лежат два главных принципа.

1. Разделение клеток по их физическим свойствам, например по размерам, плотности или заряду.

2. Разделение клеток по поверхностным антигенам.

Рис. 2.1. Основные методы разделения клеток

Среди разнообразных способов разделения клеток крови наибольшее распространение получили гравитационные, основанные на различной удельной плотности клеток крови, которые различаются между собой следующим образом: эритроциты > нейтрофилы и эозинофилы > лимфоциты и моноциты > тромбоциты.

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ

Принцип метода. Для осаждения эритроцитов из периферической крови применяют растворы декстрана, желатины и др. Гепаринизированную кровь смешивают с 6% раствором декстрана или 0,3% раствором желатины в соотношении 1:5. Смесь в пробирке отстаивают 30-40 мин под углом 45° в термостате при температуре 37 °С до осаждения эритроцитов. Плазму, обогащенную лейкоцитами, отбирают, примесь эритроцитов лизируют. Выделенные клетки отмывают центрифугированием в растворе Хенкса или культуральной среде 199 при 1000 об/мин в течение 5 мин.

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК

Мононуклеарные клетки выделяют (рис. 2.2, см. также цв. вклейку) из периферической крови человека по методу Boyum (1968), основанному на седиментации в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина. Фиколл в данной смеси выступает как агент, агрегирующий эритроциты, а изопак (или урографин) нужен для создания изотоничности и плотности 1,077 г/см³.

Принцип метода. Гепаринизированную кровь разводят в 3 раза культуральной средой и аккуратно наслаивают на градиент фиколлурографина. Кровь задерживается над фиколлом и не смешивается с ним. Постепенно эритроциты склеиваются фиколлом и опускаются на дно пробирки. Гранулоциты, имеющие плотность большую, чем седиментирующий раствор, оседают вместе с эритроцитами. Лимфоциты вместе с моноцитами остаются в интерфазе, их собирают, переносят в другую пробирку и отмывают центрифугированием.

Метод не дает выхода более 90% клеток.

Рис. 2.2. Выделение мононуклеарных клеток в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина

Лабораторная работа 2-1

1. 10 мл гепаринизированной крови человека (20-25 ЕД гепарина на 1 мл крови) разводят в 3 раза (1 часть крови и 2 части питательной среды 199).

2. Разведенную кровь наслаивают на раствор фиколл-урографина (плотность 1,077 г/см³) в соотношении 1:3 (1 часть фиколла и 3 части разведенной крови). Кровь остается над раствором фиколла и не смешивается с ним.

3. Проводят центрифугирование при комнатной температуре в течение 45 мин на центрифуге с горизонтальным ротором при 400 g.

Следует иметь в виду, что для определения необходимого числа оборотов в конкретных условиях центрифугирования или получения соответствующего центробежного ускорения одну из необходимых величин (ускорение или число оборотов) находят по формуле:

где g - центробежное ускорение; n - число оборотов в минуту; r - радиус от центра оси до границы разделяемых сред.

4. После центрифугирования собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки, в отдельную пробирку. Эритроциты склеиваются фиколлом и оседают на дно пробирки вместе с гранулоцитами (см. рис. 2.2).

5. Суспензию мононуклеарных клеток трижды отмывают средой 199, центрифугируя по 10 мин при 200 g.

6. Клетки ресуспендируют в 1 мл культуральной среды. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева. Жизнеспособность клеток определяют с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Необходимо подсчитать процент выхода жизнеспособности клеток (более 90%). Для этого подсчитывают начальное количество клеток и количество выделенных клеток.

2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ

Лабораторные методы выделения моноцитов разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с фракционированием моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластиковой поверхности или по способности при центрифугировании к локализации в определенных зонах ступенчатого градиента.

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: