МЕТОД ТИТРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ .ОДИНОЧНЫЙ ЦИКЛ

Определение числа фаговых частиц или активности суспензии, содержащей фаг. Титрование обычно проводят по методу агаровых слоев (А.Грациа, 1936). Принцип метода состоит в том, что при оптимальном соотношении каждая фаговая частица, размножаясь на бактериях, дает потомство, к-рое лизирует все бактерии, находящиеся на определенном участке плотной среды; указанный процесс проявляется в образовании негативных колоний. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) фага в 1 мл суспензии называют титром фага. Для установления титра фага накануне заготовляют бактериол. чашки с 1,5-1,6% прозрачным МПА, пробирки с 2- 2,5 мл мягкого (0,7%) питательного агара, засевают индикаторный штамм бактерий в МПБ. Перед опытом бульонную к-ру бактерий доводят до плотности 5x108 клеток/мл, а из иссл. фаговой суспензии готовят 10-кратные разведения (10-1 -10-6) на МПБ или буферном р-ре. Затем расплавляют мягкий агар, охлаждают его до 48°С, вносят в него 0,1 мл бульонной к-ры бактерий и 1 мл одного из разведении иссл. фага. Содержимое пробирки перемешивают и немедля выливают на поверхность 1,5% агара, осторожным покачиванием чашки Петри равномерно распределяют мягкий агар по поверхности плотного. Так поступают с несколькими разведениями. Количество разведении зависит от предполагаемой концентрации фаговых частиц в иссл. суспензии. Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-18 ч, после чего подсчитывают число колоний в тех чашках, где их количество находится в пределах 50 - 250. Число колоний умножают на фактор разведения и получают титр фага. Для большей объективности результатов каждое разведение фага засевают на 2 чашки. Толщина агаровых слоев, концентрация в них агара, плотность индикаторной к-ры, условия и время инкубации могут различаться для разных систем бактерия -фаг. Второй метод (Р. Аппельмана) состоит в выявлении максимального разведения фаговой суспензии (титра), к-рое дает просветление (лизис) стандартного количества индикаторной к-ры бактерий. Для этого в 10-кратные разведения иссл фаговой суспензии вносят одинаковые количества бактерий (около 250 млн/мл среды). Инкубируют в термостате 16-18 ч и определяют максимальное разведение, в к-ром имеется просветление Титр выражают степенью разведения, напр. 10-8.

Все стороны инфекционного процесса наиболее удобно изучать при одиночном цикле размножения по Эллису и Дельбрюку (1939). При этом удается определить минимальный латентный период внутриклеточного размножения фага и средний выход («урожай») фага. Латентный период определяется как минимальный период времени между адсорбцией фаха на клетке - хозяине и ее лизисом с освобождением фагового потомства. Выход фага представляет собой средний «урожай» фаговых частиц на одну инфицированную бактерию. Оба эти показателя можно определять и другими методами, но опыт одиночного цикла размножения дает возможность определить их одновременно. Методика определения следующая:1.Фаг и бактерии смешивают в концентрациях, допускающих быструю адсорбцию.2.После соответствующего периода адсорбции смесь разводят антифаговой сывороткой для прекращения адсорбции и инактивации неадсорбированного фага.3.После периода, достаточного для действия антител, смесь вновь разводят в питательной среде с таким расчетом, чтобы в каждой пробе содержалось около 100 инфицированных бактерий.4.Из суспензий инфицированных бактерий периодически (до момента завершения лизиса) берут пробы и каждую пробу испытывают методом подсчета стерильных пятен.Разведение смеси по окончании периода адсорбции — необходимый этап эксперимента, так как оно предупреждает дальнейшую адсорбцию. Если суспензию инфицированных бактерий не разводить, то многие фаговые частицы, освободившиеся из ранее лизировавшихся бактерий, адсорбируются вновь на еще не подвергшихся лизису особях и начнут второй инфекционный цикл. Антитела инактивируют неадсорбировавшийся фаг, не влияя на размножение адсорбировавшегося (Дельбрюк, 1945b). Если же оставить неадсорбировавшийся фаг неинактивированным, то при подсчетах окажется больше стерильных пятен и величина выхода фага будет занижена.Метод позволяет легко и просто определить влияние изменений физических и химических условий среды на продолжительность инфекционного - цикла и выход вируса на одну инфицированную клетку - хозяина.

Морфогенез віріонів вірусів людини та тварини

При внутрішньоклітинній репродукції вірусів формуються структури, відсутні в незаражених вірусом клітинах. Ці утворення — місця синтезу і зборки субвірусних структур (компонентів дочірніх віріонів)

Утворення, подібні з цитоплазматичними матриксами, виявлені також у ядрах, де відбувається репродукція більшості ДНК-місткихвірусів. При

фарбуванні клітин вони мають вид внутрішньоядерних включень. На пізніх стадіях інфекції в матриксах чи по сусідству з ними накопичується велике число віріонів, часто утворюючих кристалоподібні формування. Внутрішньоядерні кристалоподібні включення виявлені, наприклад, у рео-,адено-,папова-,парвовірусів. Процес формування віріонів у вірусів, що мають ліпопротеїдні оболонки, значно більш складний, чим у просто улаштованих, і протікає складніше. Так, наприклад, ізометричні нуклеокапсиди вірусу герпесу формуються в ядрах і надалі транспортуються в цитоплазму шляхом брунькування через ядерну мембрану. Після цього віріони транспортуються до апарата Гольджі, проходячи через мембрану ендоплазматичної мережі і захоплюючи її, як це було при проходженні через ядерну мембрану. Тому позаклітинний вірус має дві оболонки, одна з яких формується з ядерної, і з цитоплазматичної мембран.

Формування рибонуклеїнопротеїдних віріонів параміксовірусів відбувається в цитоплазмі, де вони накопичуються у виді тяжів і потім транспортуються до плазматичної мембрани. У цей час плазматична мембрана клітини вже модифікована, тому що в неї убудовані з зовнішньої сторони вірусні глікопротеїди, а з внутрішньої сторони — матриксний білок. При наближенні до таких модифікованих ділянок плазматичної мембрани рибонуклеопротеїдні тяжі згортаються в щільно упаковані клубки і, проходячи через плазматичну мембрану, покриваються нею, здобуваючи таким шляхом зовнішню оболонку. Цей тип формування віріонів називається брунькуванням. Брунькування може відбуватися і в внутрішньоклітинні вакуолі.

Морфогенез дрібних фагів протікає по типу самозборки. У великих фагів цей процес носить більш складний характер. Наприклад, морфогенез фага Т4 вимагає активності більш ніж 40 генів і протікає за участю трьох самостійних ліній. На одній з них відбувається збірка хвостика (бере участь близько 20 генів), на іншій - головки фага (не менше 16 генів) і на третій - складання ворсинок (5 генів). З'єднання хвостика з головкою не вимагає участі генів, проте воно не може відбутися доти, поки та хвостик, і голівка не будуть змонтовані повністю. Точно так же ворсинки можуть приєднуватися до хвостику тільки після того, як він з'єднається з повністю готовою голівкою. Завдяки суворому генетичному контролю з боку фага забезпечується послідовність і узгодженість всіх процесів його внутрішньоклітинного розмноження.

Вихід сформувалися фагів в більшості випадків відбувається завдяки лизису зсередини вільним лизоцимом. Він синтезується на самому останньому етапі розмноження фага. Іноді буває лізис бактерій ззовні як наслідок адсорбції багатьох фагів на одній клітці, але при цьому розмноження фагів не відбувається.

Зазвичай же після впровадження фагового генома в клітку у неї виникає стан імунітету до суперінфекції даними фагом, т. Е. Проникнення інших фагів геномів стає неможливим. Імунітет забезпечується особливим цитоплазматическим репрессором.

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: