Собственно-иммунный метод (экспресс)

Цель: поиск антигенов микробов в патологическом материале с помощью серологических иммунных реакций (см. реакции в приложении 6 в разделе 4).

Серологическими называют реакции иммунитета между антигенами (АГ) и антителами (AT). Детерминанта АГ связывается с активным центром AT. Соединение АГ и AT осуществляется посредством водородных и гидрофобных связей, взаимодействия ионов, кулоновских и ван-дер-вальсовых сил. Прочность соединения АГ с AT обеспечивается не только силами связывания, но и оптимальной адаптацией активного центра AT к АГ-детерминанте. Серологические реакции протекают в две фазы. Первая — специфическая невидимая — заключается во взаимодействии АГ с AT. Вторая фаза — видимая — проявляется в зависимости от типа реакции, который определяется свойствами АГ, AT и другими ингредиентами реакций. Различают несколько типов реакций: агглютинация, преципитация (иммунная диффузия), лизис, нейтрализация и др.

В реакции агглютинации (РА) антиген участвует в виде корпускулярной частицы. Это могут быть суспензии микроорганизмов, клеток организма, например эритроцитов.

При смешивании со специфической антисывороткой происходит склеивание и оседание визуально различимых хлопьев — иммунных комплексов.

Реакцию агглютинации можно ставить качественно — на стекле и количественно — в пробирках, где готовятся разведения сыворотки.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) является своеобразной модификацией РА.

Сущность ее состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов (после обработки эритроцитов танином или формалином). Такие «нагруженные» АГ эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного АГ.

Образование комплекса АГ—AT влечет за собой и склеивание эритроцитов (на дне лунки или пробирки образуется гемагглютинат в виде «перевернутого зонтика»), что легко учитывать. Таким образом, эритроциты не участвуют непосредственно в образовании комплекса АГ—AT, но служат его индикаторами.

Это тест на выявление неполных антител, которые сами не могут агглютинировать антигены, но способны к ним присоединяться. Реакцию проводят поэтапно: к сыворотке крови обследуемого добавляют эритроцитарный диагностикум — известные антигены, адсорбированные на эритроцитах. После инкубации эритроциты отмывают и добавляют кроличьи AT против человеческих глобулинов. В результате антиглобулиновая сыворотка склеивает эритроциты через образовавшиеся на них комплексы АГ—AT.

Существуют две разновидности реакции Кумбса: прямой и непрямой:

• Прямой метод: выявление антирезусных антител, адсорбированных на эритроцитах новорождённого.

Кровь берут у новорождённого, отмывают эритроциты, добавляют к ним

антиглобулиновые антитела: реализуется феномен «решётки» - происходит видимая глазом агглютинация эритроцитов

• Непрямой метод: выявление антирезусных анител в сыворотке матери.

///1. В пробирку с материнской сывороткой вносят стандартные резус-положительные эритроциты. На эритроцитах адсорбируются антирезусные антитела сыворотки матери.

2.Вносят в пробирку антиглобулиновую сыворотку (антиглобулиновые антитела): реализуется феномен «решётки» - происходит видимая глазом агглютинация эритроцитов

В реакции преципитации (РП) участвует мелкодисперсный (растворимый антиген). При контакте с антителами — преципитинами образуется осадок.

Реакцию преципитации можно проводить в жидкой среде (в узких пробирках) и в геле (в чашках Петри). При постановке РП в узких пробирках жидкость, содержащую один из реагентов, например, прозрачный экстракт из микробных клеток (0,2 мл), наслаивают на прозрачную преципитирующую сыворотку (0,2 мл). В положительных случаях на границе соприкосновения жидкостей через 1—5 минут образуется серо-белое кольцо. РП, как и РА, идет в электролите, но отличается более высокой чувствительностью.

////Схемы реакций преципитации в пробирке (А) и агаре (Б).

Одной из разновидностей РП в геле является реакция определения токсигенности дифтерийной палочки. Для этого в чашку Петри на питательную среду помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем чашку засевают испытуемыми культурами в виде пятачков на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются лини преципитации в виде дуг (усов, полуколец).

Прямая (метод Кунса). Микроорганизмы, обработанные антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в люминесцентном микроскопе.

Непрямая. На первом этапе микроорганизмы взаимодействуют со специф ческой сывороткой. Далее воздействуют на образовавшийся иммунный комплекс антиглобулиновой сывороткой, меченной флюорохромом. Иммунный комплекс с помощью этого конъюгата светится в люминесцентном микроскопе.

Это реакция лизиса антигена (например, цитолиза, бактериолиза) под действием антител с участием комплемента. Если антиген - это бактериальная клетка или вирус, то лизис не сопровождается видимыми проявлениями. Поэтому, чтобы обнаружить наличие комплекса АГ + AT + комплемент в опытной системе, где неизвестен один из компонентов (АГ или AT), используют индикаторную систему АГ + AT, где оба компонента известны и лизис антигена хорошо проявляется, так как в качестве АГ берут эритроциты. Реакция основана на способности комплемента — комплексной системы белков нормальной сыворотки позвоночных — фиксироваться на комплексе АГ—AT и последующем лизисе антигена. В РСК участвуют пять компонентов: АГ—AT опытной системы, в которой один из реагентов неизвестен, комплемента и индикаторной системы.

Индикаторная — гемолитическая система состоит из взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки кролика, полученной путем его иммунизации эритроцитами барана. Если АГ и AT в опытной системе соответствуют друг другу, то результатом этого взаимодействия является связывание комплемента. Индикаторная система выявляет свободный, несвязавшийся комплемент. Если комплемент остался свободным, то он свяжется с комплексом эритроциты — гемолитическая сыворотка и будет лизировать эритроциты. Таким образом, наличие гемолиза означает отрицательный результат РСК, а отсутствие гемолиза — положительный результат.

Высокочувствительный метод выявления АГ или AT на основе реакции АГ—AT с применением меченных ферментами АГ или AT.

Принципиальная схема иммуноферментного анализа для выявления AT следующая. Известный АГ (вирус, белок) — диагностикум — фиксируется на твердой фазе. К нему добавляют сыворотку обследуемого с неизвестными AT. После инкубации и промывки на антигене остаются специфичные к нему AT, если таковые имелись в сыворотке обследуемого. Для обнаружения комплекса АГ—AT к нему добавляют кроличью антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом (АГС-Ф). Для получения данной сыворотки иммунизируют кролика глобулинами человека. Полученную от кролика сыворотку метят каким-либо ферментом, например, пероксидазой хрена. Если в исследуемой сыворотке есть AT к АГ (диагностикум), то они будут служить антигеном для антиглобулиновой сыворотки. После второй промывки образовавшийся комплекс АГ + AT + АГС-Ф можно обнаружить, добавив субстрат к ферменту и индикатор на продукты расщепления субстрата. Изменение цвета индикатора свидетельствует о наличии искомых AT в сыворотке обследуемого.

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: