Распределение заряда в молекуле

Все белки построены из 20 типов аминокислотных остатков; в зависимости от того, может ли боковая цепь данного остатка ионизовываться, его относят к одному из трех типов: кислотному (может иметь отрицательный заряд), основному (может иметь положительный заряд) и нейтральному [ВОЛЬКЕНШТЕЙН, 1988]. Есть три типа кислотных остатков (Asp, Glu, Tyr) и три типа основных остатков (His, Lys, Arg). Заряд аминокислотного остатка зависит от pH растворителя, в который он погружен. При pH=7.0, соответствующем естественному окружению фермента, ионизованы только четыре остатка: Asp, Glu, Lys и Arg. Все дальнейшие вычисления производятся для pH=7.0.

Таким образом, мы знаем заряды и координаты всех ионизированных атомов белка и можем использовать их для вычисления электростатических характеристик фермента.

Прежде чем перейти к полученным результатам, необходимо сказать о том, каким образом используемая система координат ‘привязана’ к молекуле фермента. За начало отсчета принят атом CD1 остатка (Ile444.CD1), лежащий в основании ущелья активного центра. Ось Oz проходит через центр входа в активный участок и является, таким образом, осью ущелья. Центр входа в активный участок определен как среднее координат Glu73.CA, Asn280.CB, Asp285.CG и Leu333.O. Оси Ox и Oy ориентированы так, что атом Glu73.CA лежит в плоскости Oyz. Z -компонента координат центра входа и y-компонента координат атома Glu73.CA положительны, система координат является правой.

На рис. 6.5 представлена интегральная плотность заряда вдоль оси Oz, т. е. вдоль оси ущелья. Кривая показывает суммарный заряд между плоскостями, перпендикулярными оси ущелья; одна из плоскостей фиксирована и пересекает Oz в нуле.

Рис. 6.5. Интегральная плотность распределения заряда фермента

вдоль оси Oz в единицах заряда электрона.

Заряд «верхней» половины фермента отрицателен и составляет -14e, заряд «нижней» половины равен +2e. Таким образом, АХЭ имеет отрицательный заряд -12e. Число ионизованных атомов равно 110. Ассиметрия распределения заряда показывает, что молекула должна обладать дипольным моментом. В дальнейшем мы определим дипольный момент при различных ионных силах растворителя для сравнения с экспериментальными данными. Совпадение результатов косвенно указывало бы на правильность рассчитанного потенциала, к вычислению которого мы сейчас переходим.

6.3.2 Расчет потенциала

В естественных условиях молекулу АХЭ окружают различные ионы, содержащиеся в интерстициальной жидкости. Поэтому при расчете потенциала в растворителе необходимо учитывать влияние ионной атмосферы, возникающей вокруг каждого заряда и изменяющей его поле. Действительно, пусть имеется растворитель, содержащий различные сорта ионов. Обозначим их валентности через , концентрации ¾ через . При помещении в растворитель какой-либо системы зарядов концентрации ионов перестанут быть однородными в пространстве. Согласно распределению Больцмана

,

где ¾ электростатический потенциал. В широко распространенной теории Дебая-Хюккеля предполагается, что справедливо соотношение . Тогда, разлагая экспоненту в ряд и пренебрегая членами второго порядка малости, запишем:

.

Плотность заряда в данной точке растворителя получается суммированием плотностей заряда, даваемых каждым сортом ионов:

.

Поскольку исходный растворитель электрически нейтрален, первая сумма обращается в нуль. Тогда

,

где I ¾ ионная сила раствора,

.

В дальнейшем будет видно, что соотношение не выполняется для целых областей вблизи молекулы АХЭ, поэтому теорию Дебая-Хюккеля применять в нашем случае было бы некорректно. Ионная сила, которая появляется из уравнений Дебая-Хюккеля, не полностью характеризует ионный состав раствора (условно говоря, ионной силе 2 отвечает как раствор одновалентных ионов с концентрацией 4, так и раствор двухвалентных ионов с концентрацией 1). Тем не менее она остается широко используемой. Но здесь на выручку приходит тот факт, что ионный состав интерстициальной жидкости, в которой функционирует фермент, представлен в основном одновалентными ионами , , и (табл. 6.1).

Катионы	Концентрация, мМ	Анионы	Концентрация, мМ
		Органические анионы

Табл. 6.1. Ионный состав интерстициальной жидкости.

Используемая здесь единица концентрации M соответствует одному молю растворенного вещества в одном литре раствора: 1 M = 1 моль/литр.

Итак, считая наведенную ионами плотность заряда равной

,

где ¾ концентрация положительных одновалентных ионов, ¾ концентрация отрицательных одновалентных ионов, = = из-за нейтральности раствора, получаем:

.

Уравнение Пуассона для потенциала примет вид

,

где - плотность распределения зарядов атомов фермента.

Данное уравнение числено решалось на сетке 100´100´100 точек, шаг сетки соответствовал 1 , оператор Лапласа аппроксимировался разностным оператором, полученная система решалась методом простых итераций. Значение диэлектрической проницаемости принято равным 80.

На рис 6.6 изображены эквипотенциали электростатического поля при нулевой ионной силе. Указанные энергии соответствуют заряду +1e. На рис. 6.7 представлен потенциал фермента на оси ущелья при ионных силах 0, 10 и 20 мМ.

а) б)

Рис. 6.6. Эквипотенциали электростатического поля молекулы АХЭ

при нулевой ионной силе. Указанные энергии соответствуют заряду +1e.

а) «Черный ход» закрыт; б) «черный ход» открыт.

0 mM 10 mM 20 mM

Рис. 6.7. Потенциал АХЭ на оси ущелья активного центра

при различных ионных силах.

Возвращаясь к вопросу о применимости теории Дебая-Хюккеля видим, что в точке с наименьшим потенциалом и ее использование в данном случае недопустимо.

6.3.3 Определение дипольного момента

Зная теперь не только заряды атомов белка, но и плотность наведенного заряда, можем вычислить дипольный момент системы фермент плюс ионная атмосфера:

,

где в случае растворителя означает произведение плотности заряда в данной точке на объем ячейки дискретизации. Дипольный момент системы зарядов, сумма которых отлична от нуля, зависит от выбора системы координат, поэтому расчет производился относительно центра масс по формуле

,

где - радиус-вектор центра масс. Результаты вычислений для некоторых значений ионной силы вместе с экспериментальными данными, основанными на измерении постоянного и переменного электрического дихроизма в полях различной силы, представлены на рис. 6.8. (Подробности см. в [1,2].

Рис. 6.8. Зависимость дипольного момента d от ионной силы I.

Квадратиками показаны рассчитанные значения дипольного момента;

кружками - экспериментальные.

Математическая модель.

Используя результаты рентгеноструктурного анализа, представим фермент набором жестко связанных неподвижных точек, относительное расположение которых соответствует расположению атомов в молекуле AChE. Для сравнения скорости выхода “осколков” из ущелья в случае закрытого и открытого “back door” используем две модели фермента. Первая модель соответствует молекуле AChE с закрытой “back door” и содержит все атомы, определенные рентгеноструктурным анализом. Вторая модель, соответствующая ферменту с открытой “back door”, должна иметь канал, через который продукты реакции могли бы покинуть ущелье активного центра. Поэтому из второй модели необходимо исключить некоторое количество атомов, определенных рентгеноструктурным анализом. Сделаем это следующим образом. Будем считать, что канал имеет цилиндрическую форму, радиус канала примем равным 5 . Путем варьирования направляющего вектора оси цилиндра и координат некоторой точки, лежащей на оси “back door”, определим такое положение канала, при котором в него попадает наименьшее число атомов фермента. Удалив оказавшиеся внутри канала атомы (принадлежащие остаткам Trp⁸⁴ и Met⁸³, что согласуется с приведенными в [9] данными), получим вторую модель фермента.

Субстрат и его “осколки” также представим набором жестко связанных точек. Однако, в данном случае для уменьшения времени счета не будем считать подвижные объекты состоящими из большого числа атомов, а отобразим молекулы ацетилхолина и холина в виде гантелей и молекулу ацетата в виде шара. Размеры гантелей и шара определим из результатов рентгеноструктурного анализа для соответствующих молекул.

Наделим каждую точку соответствующими массой и зарядом. Ван-дер-ваальсово взаимодействие двух точек, принадлежащих различным объектам (например, ферменту и продукту реакции), представим потенциалом Леннарда-Джонса:

где r - расстояние между точками; константы A и B для различных пар атомов приведены в [1]. Учет ударов молекул растворителя произведем по методу Ланжевена, т. е. введем в уравнения движения случайную силу [17].

Полагая фермент жестко закрепленным, будем описывать трансляционное движение подвижных объектов координатами и скоростями их центров масс. Для описания вращательного движения с центром масс каждого объекта свяжем подвижную систему координат. Ориентируем ее оси таким образом, чтобы тензор инерции принял диагональный вид. Это можно сделать следующим способом. В системе координат, связанной с центром масс, рассчитывается тензор инерции, определяются его собственные вектора и оси новой системы направляются вдоль собственных векторов. Тогда уравнения движения l-го тела запишутся наиболее просто [18]:

Здесь

m_l - масса тела;

x_l, y_l, z_l - координаты центра масс в декартовой системе;

J_l1, J_l2, J_l3 - компоненты тензора инерции;

W_l1, W_l2, W_l3 - частоты вращений вокруг осей собственной системы координат;

, , - координаты i-ой точки тела в собственной системе координат;

x_lx, x_ly, x_lz - проекции случайной силы на оси лабораторной системы координат;

z_l1, z_l2, z_l3 - проекции случайного момента сил на оси подвижной системы координат;

g_l - коэффициент, учитывающий силу вязкого трения;

g_l1, g_l2, g_l3 - коэффициенты, учитывающие силу вязкого трения при вращательном движении;

, , - проекции силы , приложенной к i-ой точке тела, на оси лабораторной системы;

, , - то же на оси подвижной системы координат.

Сила учитывает ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия:

Здесь - ван-дер-ваальсова сила, действующая на i-ю точку l-го тела со стороны j-ой точки другого тела (индекс j пробегает по всем точкам всех тел, за исключением l-го тела); - заряд i-ой точки l-го тела; - напряженность поля.

В процессе численного счета трансляционное брауново движение моделировалось следующим образом. Через равные интервалы времени скорость центра масс l-го тела изменялась на величину , где - амплитуда добавочной скорости, - равномерно распределенная в кубе [-1,1;-1,1;-1,1] случайная векторная величина. В остальное время тело двигалось согласно уравнениям (1) с нулевой случайной силой. Используя теорему о равнораспределении энергии по степеням свободы при диффузии в свободном пространстве в отсутствие электростатических полей , получим следующее выражение для амплитуды шума: .

Аналогичным образом моделировалось вращательное брауново движение. Через равные интервалы времени угловая скорость вращения вокруг i-ой оси изменялась на величину , где - амплитуда добавочной угловой скорости, h_i - равномерно распределенная на отрезке [-1,1] случайная величина. Амплитуды добавочных угловых скоростей задаются следующей формулой: .

В качестве примера рассмотрим определение скорости связывания субстрата с ферментом или константы k₁.

§3.4. Определение константы скорости k₁.

Константа k₁ определяет скорость образования комплекса E^S из независимых молекул фермента и субстрата:

w₁=k₁[E][S].

Воспользуемся следующей схемой определения этой константы. Ограничим область вблизи основного входа в ущелье активного центра непроницаемыми для молекулы субстрата стенками в форме цилиндра (рис. 3.5). Поместим случайным образом в эту область молекулу ACh и промоделируем ее диффузию в поле, порождаемом ферментом. Если z-компонента координат субстрата становится меньше z₁, то считаем комплекс E^S образовавшимся. Многократно повторяя данный этап, определим частоту n образования комплекса E^S при условии, что молекула субстрата все время находится в данной области.

Рис. 3.5. Объем, ограничивающий область около входа в активный центр.

Субстрат расположен на оси Oz в точке z₁.

Пусть средняя по объему концентрация субстрата в выделенной области равняется [S]₁. Тогда среднее отношения времени t, когда субстрат находится в выделенной области, ко времени наблюдения T равняется

где V₁ - объем выделенной области. Записанное соотношение справедливо при условии [S]₁V₁<<1; иначе необходимо принимать во внимание те моменты времени, когда в объеме V₁ находятся две и более молекул субстрата.

Очевидно, при наличии только одной свободной молекулы фермента частота образования комплекса E^S равняется k₁[S]; следовательно,

Средняя концентрация [S]₁ субстрата в области V₁ выражается из распределения Больцмана следующим образом:

, (3.9)

где q - заряд субстрата (+1e).

Введем обозначение

;

тогда

. (3.10)

В процессе численного счета объем V₁ ограничивался плоскостью z₂=35 и цилиндром радиусом R=8 . Ось Oz являлась осью цилиндра. Значение z₁ было принято равным 20 . Для интегрирования уравнений движения субстрата использовался метод Эйлера с временным шагом 2*10^-14 с. Одна из реализаций, полученных в ходе моделирования при нулевой ионной силе, представлена на рис. 3.6. По оси абсцисс здесь отложено время моделирования, по оси ординат - количество образовавшихся за это время E^S-комплексов. По нескольким реализациям, аналогичным отображенной на рис. 3.6, определялось среднее значение и границы 66%-го доверительного интервала для частоты n. Для искомой константы скорости, исходя из уравнения (3.10), получена отображенная на рис. 3.7 зависимость k₁ от ионной силы.

Рис. 3.6. Зависимость количества образовавшихся E^S-комплексов N

от времени моделирования при нулевой ионной силе.

Рис. 3.7. Зависимость константы скорости k₁ от ионной силы I.

Указанные погрешности соответствуют 66%-му доверительному интервалу.

РЕЗУЛЬТАТ МОДЕЛИРОВАНИЯ С «BACK DOOR»

Рассматривалась возможность объяснения эффекта субстратного торможения увеличением времени выхода продуктов реакции из ущелья. Это рассмотрение могло бы дать ответ на вопрос о том, имеется ли “back door” в молекуле AChE. Действительно, если бы рассчитанное значение [S]_опт для молекулы фермента без “back door” оказалось значительно меньше экспериментального, мы имели бы аргумент в пользу наличия дополнительного канала в ущелье активного центра. Однако даже при концентрации субстрата, на порядок превосходящей экспериментальное значение [S]_опт, среднее время выхода оставалось на четыре порядка меньше времени, определяющего химические стадии реакции. Таким образом, на основании имеющихся экспериментальных данных мы не можем утверждать, что в молекуле AChE происходит открытие дополнительного канала в ущелье активного центра.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом мы рассмотрели математическую модель связывания субстрата. С моделями других этапов работы молекулярных ножниц можно ознакомиться по монографиям [1,2].

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: