КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРОБОВ В ПОЧВЕ

Микроорганизмы в почве распределены неравномерно. Поэтому для их учета в этой среде взятые образцы смешивают в стерильной банке. Из средней пробы 1 г почвы переносят в колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды (получается разведение 10^-2, его готовят заранее).Из разведения 10^-2 1 мл переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (получается разведение 10 ^-3) и т. д. Схема приготовления разведении:

2. 1 мл разведения 10 ^-2 -|- 9 мл стерильной воды— 10 ^-3

3. 1 мл разведения 10 ^-3 + 9 мл стерильной воды —10 ^-4.

4. 1 мл разведения 10 ^-4 + 9 мл стерильной воды — 10 ^-5

Из последних разведении по 1 мл вносят в стерильные чашки, после чего заливают по 10—12 мл расплавленного и охлажденного до 45°С МПА, содержимое равномерно распределяют и оставляют на ровной поверхности. Чашки с застывшей средой переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Через 3—4 дня подсчитывают выросшие колонии, умножают на разведение и определяют количество живых микроорганизмов в 1 г сырой почвы.

Для пересчета на 1 г абсолютно сухой почвы ее высушивают до постоянной массы, устанавливают влажность и вносят поправку.

ЗАНЯТИЕ 9. Учёт результатов посева воды и воздуха. Коли-титр, коли-индекс. Санитарная оценка воды.

Цель занятия. Подсчитать колонии (в чашках Петри). Провести подсчет микробов из воздуха в разных комнатах, высеянных седиментационным методом по Коху. Ознакомиться с определением коли-титра, коли-индекса и санитарной оценкой воды, а также с определением количества микробов в почве методом прямого счета под микроскопом.

Оборудование и материалы. Чашки Петри, в которые сделан посев воды и воздуха. Почва. Стерильная вода. Стерильная колба. Стерильные пипетки (10 мл) и микропипетки (0,1 мл). Предметные стекла. Крышки от чашек Петри. Окулярная сетка. Горелки, спички.

Для демонстрации хорошей и плохой воды: два ряда колб и пробирок со средой Булижа и высеянной в нее водой с коли-титром в первом ряду 0,1; во втором ряду— 100. Рост Е. coli на среде Эйкмана, РДА.

Определение коли-титра. Коли-титр — наименьшее количество воды (мл), в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка. Наличие кишечной палочки в воде указывает на загрязнение ее содержимым желудочно-кишечного тракта. В отличие от других микроорганизмов воды, кишечная палочка может развиваться при температуре 43—46⁰С, легко сбраживает углеводы с образованием кислоты и газа. Это свойство микроба положено в основу определения коли-титра. Существует несколько методов определения коли-титра.

Определение коли-титра на среде Эйкмана. Исследуемую воду высевают на среду Эйкмана (пептон 1 г, натрия хлорид 0,5 г, глюкоза 0,5 г, водопроводная вода 100 мл, рН 7,4—7,6). При необходимости готовят концентрированную среду, для этого количество веществ, кроме воды, увеличивают в 10 раз. Глюкозу можно заменить лактозой или маннитом. Водопроводную воду, в зависимости от численности людей в населенном пункте, сеют:

а) в городах до 1 млн. человек в объеме 300 мл: два объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл;

б) в городах свыше 1 млн. человек в объеме 500 мл: четыре объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл.

Чистую воду открытых водоемов сеют в количестве 100, 10 и 0,1 мл (1 мл воды, разведенной 10 ^-1); загрязненную—10, 1 и по 1 мл воды, разведенной 10 ^-1, 10 ^-2, 10 ^-3 и т. д. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С и выдерживают в течение суток. Через 7—12 ч пробирки на время вынимают из термостата и делают пересев в розоловый дифференцированный агар (РДА). На РДА выращивают при 37 "С, и если имеется кишечная палочка, то через 12—17 ч среда желтеет, разрывается. Среда Эйкмана к этому времени (24 ч) мутнеет, образуется газ. При необходимости проводится идентификация Е. coli.

Состав РДА. МПА (рН 7,4—7,6) 100 мл, желчи 5 мл, лактозы 1 г, глюкозы 0,1 г, 1%-ного спиртового раствора индикатора бромтимолового синего и 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты по 0,2 мл. Среду разливают по 3—4 мл в пробирки и стерилизуют в течение 15—20 мин при температуре 112°С. Часть среды скашивают, так как посев делают уколом и на скошенную поверхность.

Посевы помещают в термостат на сутки при температуре 43°С. Рост сапрофитной микрофлоры при этой температуре подавляется. При наличии кишечной палочки она сбраживает маннит, индикатор (нейтральный красный) редуцируется, и среда принимает соломенно-желтое окрашивание, мутнеет, в «газовках» появляется воздух.

Для того чтобы убедиться, что изменения произведены кишечной палочкой, из пожелтевшей среды делают посев на среду Эндо. Посевы на среде Эндо помещают в термостат (37 °С) на сутки. Появление красных с металлическим блеском колоний, обнаружение при микроскопии грамотрицательных палочек и соответствующих изменений на цветном ряду подтверждают наличие кишечной палочки.

Определение коли-индекса методом мембранных фильтров. Мембранные фильтры, употребляемые при исследовании воды, имеют различную проницаемость и разные номера. Наиболее часто применяют фильтр №3. Фабричные фильтры дважды кипятят в дистиллированной воде (в химическом стакане). Затем подготовленные бумажные фильтры накладывают матовой поверхностью кверху на сетку асбестового фильтра Зейтца. Через фильтр пропускают определенное количество воды (до 500 мл, в зависимости от загрязнения). После фильтрации с помощью фламбированного пинцета фильтр кладут блестящей поверхностью на среду Эндо в чашки Петри. Чашки ставят в термостат при температуре 37 ° С или лучше при 43°С на сутки. На белой поверхности фильтров при наличии кишечной палочки появляются красные колонии, которые и подсчитывают. Методом мембранных фильтров определяют коли-индекс, то есть количество кишечных палочек, содержащееся в 1 л воды. Для перевода коли-титра в коли-индекс необходимо 1000 разделить на число, показывающее коли-титр. Для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли-индекс.

Пример. При коли-титре, равном 10, коли-индекс равен 100. При коли-индексе, равном 5, коли-титр равен 200.

Санитарная оценка воды. Согласно ГОСТ 2874—73 на питьевую воду, общее количество микробов (микробное число) в 1 мл при посеве не разведенной воды и выдерживании ее в течение 24 ч при 37 °С должно быть не более 100. В 1 л воды при определении методом мембранных фильтров кишечных палочек должно быть не более трех. При использовании бродильных проб титр кишечной палочки должен быть не менее 300. К водопроводной воде в городах с населением свыше 1 млн. человек должны предъявляться более высокие требования.

Вода открытых водоемов считается хорошей при коли-титре 100, коли-индексе 10. При коли-титре ниже 1 вода непригодна к употреблению. Следовательно, чем выше коли-титр, тем вода чище, лучше, и наоборот, чем ниже, тем качество ее хуже.

Для демонстрации плохой и хорошей воды открытых водоемов ее высевают на среду Булижа: в первый ряд — с коли-титром 100 и выше (вода хорошая); во второй—с коли-титром 0,1 и ниже (вода плохая). По изменению окрашивания среды (от малиново-красной до желтой) можно установить наличие кишечной палочки в определенном объеме исследуемой воды и ее качество.

Подсчет колоний в чашках Петри. На мясопептонном агаре в чашках Петри подсчитывают выросшие колонии из разведении 10 ^-2, 10 ^-1 и не разведенной воды. После подсчета колоний получаемый результат умножают на разведение и определяют среднее число. Качество воды оценивают по содержанию микробов в 1 мл:

Содержание микроорганизмов в воздухе разных комнат определяют путем подсчета колоний на всей поверхности питательной среды чашки. В зависимости от количества выросших колоний делают заключение о микробной загрязненности воздуха в помещении.

Чистым воздух считается в том случае, если в 1 м ³ летом содержится 1500, а зимой —4500 микроорганизмов; в загрязненном воздухе соответственно 2500 и 7000 микробов (по А. И. Шарифу).

Определение численности микробов в почве методом прямого счета. Наряду с другими методами число микробов в почве можно определить прямым подсчетом их под микроскопом. Такие методы разработаны С. Н. Виноградским (1952), Д. Г. Звягинцевым (1959) и другими исследователями. Подсчет микробов по Виноградскому проводят под обычным световым микроскопом, в то время как для выполнения подобной работы по Звягинцеву требуется флуоресцентный микроскоп, который может быть не в каждой студенческой лаборатории.

Метод прямого счета микробов под микроскопом, предложенный С. Н. Виноградским, имеет ряд достоинств, но он громоздок, поэтому его чаще применяют в модификации О. Г. Шульгиной. Он сводится к следующему. Из средней пробы отвешивают 5 г почвы и вносят в Эрленмейеровскую колбу объемом 250 мл. Почву заливают 50 мл стерильной воды, встряхивают в течение 5 мин, после чего в течение 1 мин отстаивают. Из колбы стерильной пипеткой берут 0,01 мл суспензии и распределяют ее на площади 4 см² предметного стекла (под стекло кладут очерченный квадрат такой же площади). После подсушивания препарат заливают тонким слоем 0,1%-ного водного раствора агара, вновь подсушивают, фиксируют 96 %-ным этиловым спиртом в течение 10—20 мин и окрашивают 1—2 мин фуксином основным феноловым Циля или другим красителем. Затем краситель сливают и смывают его путем погружения стекла до 5 раз в стакан с водой. Высушивают на воздухе. Количество клеток подсчитывают под иммерсионным объективом микроскопа в 50—100 квадратах окулярной сетки, которую помещают на постоянную металлическую диафрагму между глазной и собирательной линзами окуляра. При объективе Х90 и окуляре XI0 сторона клетки окулярной сетки равна 0,02 мм, а ее площадь 0,0004 мм².

Расчет. При увеличении в 900 раз на площади в 1 см вмещается 25*10 ⁴квадратов окулярной сетки (1 см ²= 100 мм ², 100 мм ²:0,0004= 25*10 ⁴), а на 4 см

Для определения микробов в 1 г почвы необходимо среднее количество клеток в одном квадрате окулярной сетки умножить еще на 1000, так как в 0,01 мл суспензии содержится 0,001 г почвы. При наличии в квадрате окулярной сетки трех микробных клеток в 1 г почвы их будет 3*10 ⁹, при наличии пяти—5*10 ⁹и т. д.

ЗАНЯТИЕ 10. Исследование микрофлоры кормов. Цель занятия. Ознакомиться с правилами взятия проб силоса для исследования. Определить микрофлору силоса № 1 и № 2: приготовление и микроскопия мазков; ознакомление с микробиологическим исследованием силоса (посевы и учет основных физиологических групп микроорганизмов на разных средах). Оценить качество силоса № 1 и 2 по А. Н. Михину.

Оборудование и материалы. Фарфоровые ступки с пестиками (стерильные). Предметные стекла. Краситель эритрозин. Горелки. Микроскопы. Кедровое масло. Силос № 1 и 2 в чашках. Вытяжки из силосов. Универсальный индикатор, пипетки. Фарфоровые чашки для определения рН. Стандарт (цветная шкала для определения рН). Весы и разновесы к ним. Чашки для взвешивания силоса. Пинцеты. Две банки с притертыми пробками. Банка с разведением силоса 1:10 (40 г силоса-360 мл стерильной воды). Шесть колб со стерильной водой по 90 мл в каждой. Пипетки для приготовления разведений (на 10 мл). Штатив с питательными средами: МПА - 5 пробирок, СА - 4, САМ (сусло-агар с мелом) - 6, молоко - 6, сусло пивное - 6, лактоза - 5, картофельная среда Рушмана -5 пробирок.

Микрофлора кормов во многом обусловлена температурой, влажностью среды и видовым составом растений. Она меняется во время заготовки и последующего хранения кормов. После скашивания нарушаются защитные функции растения, микробы проникают внутрь, используют питательные вещества и разрушают ткани. В это время особенно бурно развивается гнилостная микрофлора, вызывая порчу кормов. Скошенные растения можно сохранить путем высушивания или силосования, когда недостаточно свободной воды или создаются такие условия, при которых прекращается деятельность аммонификаторов. Наряду с заготовкой сена и сенажа в кормопроизводстве многих хозяйств одно из первых мест занимает силосование.

В кормах могут быть обнаружены плесневые грибы, гнилостные, масляно-кислые и другие микроорганизмы. Такие корма часто вызывают отравления, расстройство органов пищеварения и других систем. В результате исследования можно выявить причину порчи корма, устранить ее и тем самым предупредить заболевание животных.

Определение микрофлоры силоса. Взятие проб силоса. Пробы силоса необходимо брать в три срока: а) во время закладки силоса для определения эпифитной микрофлоры; б) через 10—15 дней после закладки для определения микрофлоры созревшего силоса; в) при вскрытии силоса.

В общей массе силоса не во всех ее участках одинаково проходят микробиологические процессы, поэтому в башне берут три пробы силоса: первую и вторую — на расстоянии одного метра от верха и низа, третью — между ними. В траншеях, в зависимости от длины, берут две или три пробы на глубине одного метра от поверхности. В круглых ямах пробу берут в центре после снятия верхнего слоя, также на глубине одного метра. Пробы силоса помещают в стерильные банки с притертыми пробками.

Микроскопическое исследование силоса. В фарфоровой ступке (с небольшим количеством стерильной дистиллированной воды) растирают кусочек силоса. Из растертой массы на предметном стекле пестиком делают мазок, затем его фиксируют и окрашивают эритрозином. Мазок рассматривают под иммерсионной системой и зарисовывают. В хорошем силосе встречаются единичные палочки и кокки, в плохом силосе обнаруживается большое число кокков и палочек.

Микробиологическое исследование силоса проводят для выявления разных физиологических групп микроорганизмов; молочнокислых, масляно-кислых, гнилостных, газообразующих, дрожжей и плесеней.Перед посевом готовят разведения. С этой целью на технических весах отвешивают 40 г силосной массы. Навеску с соблюдением правил стерильности переносят в стерильную банку с притертой пробкой, в которую налито 360 мл стерильной воды. Чтобы «отмыть» микроорганизмы, содержащиеся на поверхности растений, силос в банке взбалтывают в течении 10 мин на шуттель-аппарате или руками. В банке получается разведение 1:10. К этому времени должны быть готовы колбы со стерильной водой по 90 мл в каждой и сделаны надписи: II, III, IV, V, VI, VII. Последующие разведения готовят путем внесения 10 мл разведения 1:10 во вторую колбу с 90 мл стерильной воды, в результате чего получается разведение 1:100. Из второй колбы 10 мл разведения 1:100 переносят в третью колбу, получается разведение 1:1000 и т.д. Содержимое колбы перед взятием разведения силоса взбалтывают в течение 3 мин. После приготовления разведении готовят посуду (чашки Петри, пробирки), делают надписи.

Физиологические группы микроорганизмов определяют на следующих питательных средах:

лактозе - газообразующие (кишечные) бактерии,

картофельной среде Рушмана - масляно-кислые бациллы.

В приготовленную посуду и среды, начиная с последней колбы, вносят по 1 мл разведении: на МПА с I, II, III, IV, V разведениями; на СА с I, II, III, IV; на САМ со II, III, IV, V, VI, VII; на молоко с II, III, IV, V, VI, VII; на сусло пивное с II, III, IV, V, VI, VII; на лактозу с I, II, III, IV, V; на картофельную среду Рушмана с I, II, III, IV, V разведениями.

После охлаждения питательных сред до 50—45⁰С (а САМ и после тщательного взбалтывания) их вносят в чашки. Легкими вращательными движениями чашек смешивают разведения силоса со средой и оставляют на ровной поверхности для застывания. Чашки, перевернутые вверх дном, выдерживают в термостате при температуре 30—35°С в течение трех суток. На четвертые сутки проводят учет физиологических групп микроорганизмов. Численность разных физиологических групп микроорганизмов на плотных питательных средах определяют путем подсчета колоний, на жидких питательных средах — путем обнаружения роста микробов из разных разведении, а на молоке — по свертыванию его. Та из свернувшихся сред, в которую было внесено наибольшее разведение, и будет определять количество молочнокислых микроорганизмов в силосе. На плотных средах в чашках Петри подсчет ведут из трех разведении, в каждом из которых выросло не менее десяти колоний.

Оценка качества силоса. Органолептическая оценка силоса. Цвет должен быть ближе к цвету растений, из которых приготовлен силос. У доброкачественного силоса могут встречаться оттенки: желтый, желто-зеленый, коричнево-зеленый, светло-коричневый. У испорченного силоса преобладает коричневый цвет; обычно он бывает темно-коричневый, грязный. Запах доброкачественного силоса должен быть приятным, напоминающим запах плодов, хлебного кваса, моченых яблок. При порче силоса появляется запах уксуса. Испорченный силос имеет запах редьки, прогорклого масла, селедки, долго не исчезающий при растирании кусочка силоса между пальцами. При наличии в силосе масляной кислоты растертый между пальцами силос издает неприятный запах навоза. Вкус доброкачественного силоса слабокислый, приятный. У испорченного силоса вкус резко кислый с горьковатым привкусом. Консистенция у доброкачественного силоса должна быть такой, какую имели исходные растения. У испорченного силоса растительная масса делается ослизлой, мажущейся, листочки не отделяются друг от друга.

Химическая оценка силоса. Приготовление вытяжки из силоса. В литровую банку (колбу) помещают 100 г мелко нарезанного силоса. В банку приблизительно до 3/4 объема наливают дистиллированную воду, тщательно взбалтывают и доливают до литра. Содержимое в течение 4—5 ч периодически взбалтывают. Затем отфильтровывают и фильтрат используют для разных целей (например, для определения рН).

Определение рН силоса. Для определения рН силоса готовят две вытяжки: одну из хорошего силоса, другую — из заведомо недоброкачественного. Пипеткой в фарфоровую чашечку или углубление вносят 1 мл вытяжки и каплю универсального индикатора. При смешивании жидкостей происходит изменение окраски вытяжки. Реакцию (рН силоса) определяют по стандартной шкале, которая нанесена на бумаге с защитным покрытием. По А. Н. Михину, в качестве индикатора используют смесь бромтимолового синего и метилового красного. В углубление фарфоровой чашки вносят 2 мл вытяжки и 2—3 капли смеси индикаторов. В зависимости от величины рН вытяжка приобретает разную окраску, которую находят по таблице.

Оценка качества силоса в баллах (по А. Н. Михину)

Данные балльной оценки при определении рН, запаха, цвета суммируют, получают общий балл, по которому и определяют качество силоса, баллов:

На практике рН силоса определяют также колориметрическим, электрометрическим и другими методами.

Силос, имеющий оценку 3 балла и ниже, считается очень плохим и к скармливанию животным непригоден.

Исследование силоса на присутствие в нем токсина ботулинуса. Силос часто загрязняется почвой, в которой наряду с другими микроорганизмами могут быть бациллы ботулинуса (Cl. botulinum). Такие микробы в силосуемой массе распределяются неравномерно, гнездно, то есть там, где имеется почва. Из подозрительных участков берут 1—2 кг силоса и помещают его в стерильные широкогорлые колбы. Пробы заливают двойным количеством стерильной воды и оставляют для экстрагирования. Затем часть воды и корма переносят в стерильную фарфоровую ступку и растирают. Выдерживают 1—2 ч и после этого фильтруют до получения прозрачной жидкости.

Наличие токсина ботулинуса в силосе определяют на морских свинках или белых мышах. Фильтрат делят на две части: одну из них нагревают до 80-100°С для разрушения токсина, другую оставляют без изменения. Опыт ставят на четырех свинках. Материал выпаивают при помощи шприца с конюлей или шприца без иглы. Двум животным дают по 2 мл прогретого фильтрата, остальным — такое же количество фильтрата, но не подвергавшегося термической обработке.

При содержании в непрогретом фильтрате токсина у животных появляются параличи задних конечностей, брюшных мышц и другие признаки, характерные для отравления. Морские свинки обычно в течение 2—3 сут погибают. Это дает основание (при отсутствии клиники болезни у контрольных животных, которым выпаивали прогретый фильтрат) считать, что в исследуемом материале имеется токсин.

Определение наличия токсина в силосе можно проводить и на белых мышах, при этом дозу фильтрата уменьшают до 0,5_1 мл. Отсутствие характерной клиники болезни не исключает наличие токсина ботулинуса в корме, поэтому исследование повторяют.

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: