Выделение чистых культур патогенных клостридий

Микроскопия и пересев на мясную или казеиновую среду колоний, вызывающих гемолиз, покраснение, опалесценцию или почернение на одной из указанных сред и состоящих из грамположительных палочек, для получения чистых культур и последующего изучения их свойств.

Среда Виллиса-Хоббс: смесь (400 мл бульона Хоттингера + 4,8 грамма агара; 4,8 грамма лактозы и 1,3 мл 1% раствора нейтрального красного) автоклавируют, охлаждают до 55-50 и добавляют 15 мл суспензии яичного желтка и 60 мл стерильного обезжиренного молока.

2. Причины высокой чувствительности строгих анаэробов к кислороду объясняют следующими обстоятельствами:

1. Отсутствием у них каталазы (в присутствии кислорода накап-
ливается перекись водорода, которая и оказывает бактерицидное
действие на анаэробы).

2. В аэробных условиях тормозятся анаэробные энергетические
процессы (пастеровский эффект).

3. Отсутствием у анаэробов систем регуляции окислительно-
восстановительного потенциала. В присутствии кислорода он повы-
шается, анаэробы не могут понизить его до необходимого уровня, и
поэтому их рост подавляется.

Тема: Бактериологический метод (3 день). Идентификация чистых культур бактерий. Биохимическая активность бактерий.

Итоговое контрольное занятие «Морфология и физиология бактерий».

1. Ферменты бактерий. Регистрация результатов посева на среды пестрого ряда.

2. Регистрация результатов опыта с посевами бактерий на среды Эндо, Плоскирева и МПА.

3. Итоговый контроль по теме «Морфология и физиология бактерий».

1. Зарегистрировать результаты посева на среды «пестрого ряда» кишечной палочки и фекального щелочеобразователя. Ферментация углевода с образованием кислоты и газа обозначается буквами КГ; с образование только кислоты - буквой К. Свертывание молока и образование индола обозначается +; отсутствие ферментации углевода, свертывания молока или образования индола и сероводорода обозначается знаком -.

Результаты посева на среды “пестрого ряда”.

Заключение:_____________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________

2. Отметить различия в характере роста кишечной палочки и фекального щелочеобразователя (размер, прозрачность и окраска колоний на средах Плоскирева и Эндо), а также интенсивность роста их и стафилококка на средах Плоскирева, Эндо и МПА. В случае роста бактерий в виде отдельных колоний подсчитать количество колоний каждого вида бактерий на всех средах. Результаты зарисовать и зарегистрировать в таблице.

Результаты посева на среды Плоскирева, Эндо, МПА

Вопросы к итоговому контролю по теме «Морфология и физиология бактерий».

2. Спора бактерий, строение, назначение, отличия от спор грибов.

3. Основные компоненты белоксинтезирующей системы бактерий.

6. Основные отличия между прокариотами и эукариотами.

8. Признаки, применяемые для идентификации микроорганизмов.

9. Определения всех методов микробиологической диагностики.

11. Классификация бактерий по количеству и взаиморасположению жгутиков.

12. Методы определения подвижности бактерий.

14. Принцип окраски бактерий по Граму, отличия клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

15. В каких случаях употребляются термины «бактерии», «бациллы», «клостридии»?

16. Что такое L-формы бактерий, в каких случаях они возникают?

19. Что такое конститутивные, индуцибельные, репрессибельные ферменты?

20. Отличия между ядерным аппаратом прокариот и эукариот.

21. Структура и функции цитоплазматической мембраны.

23. Что такое мини-клетки, когда они образуются?

24. Типы дыхания бактерий, сущность и разница.

25. Строение и функции липополисахарида клеточной стенки.

28. Классификация бактерий по морфологии и взаиморасположению.

29. Механизм деления бактерий. Время жизни клетки (формула).

30. Механизмы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.

32. Классификации питательных сред, требования к ним.

35. Причины чувствительности анаэробов к молекулярному кислороду воздуха.

37. Состав и химизм работы среды Вильсон-Блера.

38. Что такое волютин, как его выявляют и у каких бактерий?

39. Этапы выделения чистой культуры возбудителя.

40. Как изучают протеолитические свойства бактерий?

41. Как изучают сахаролитические свойства бактерий?

43. Определение подвижности бактерий по Пешкову.

44. Как у бактерий определяют способность выделять индол?

45. Как у бактерий определяют способность выделять сероводород?

46. Состав среды Эндо, как на ней растут разные кишечные бактерии?

47. Как изучают развернутые биохимические свойства бактерий?

49. Как судят о чистоте выделенной культуры микроорганизма?

51. Плесневые (нитчатые) грибы, родовые морфологические отличия.

52. Микроскопическая дифференциальная диагностика малярии.

53. Назвать патогенных простейших из класса Flagellata.

54. Морфология трипаносом, какие заболевания они вызывают?

55. Морфологические отличия дрожжей и дрожжеподобных грибов Candida.

56. Морфология токсоплазмы, ее роль в патологии человека.

57. Диагностика амебиаза, морфология и жизненный цикл возбудителя.

58. Морфологические отличия возбудителя вивакс и тропической малярии.

59. Чем отличается лейшманиальная форма лейшмании от лептомонадной?

60. Патогенные спирохеты, морфология и классификация.

Тема: Бактериофагия. Генетика микроорганизмов. Мутации и рекомбинации.

1. Явление бактериофагии. Демонстрация феномена бактериофагии на жидких и плотных средах.

3. Типы и механизмы генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация (разбор схем).

2.Плазмиды бактерий. Классы и свойства R-плазмиды.

3.Молекулярные механизмы мутаций у бактерий (разбор).

4.Получение рекомбинантных молекул ДНК (разбор).

1. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.

2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Грациа. Сущность этого метода состоит в следующем.1,5%-ный МПА с генцианвиолетом (0,1 мл 0,1% генционвиолета на 1 л среды), который добавляется для предохранения от загрязнения грамположительной воздушной микрофлорой, накануне опыта разливают по 25-30 мл в чашки Петри. Чашки хорошо просушивают в термостате или под бактерицидной лампой, после чего оставляют на ночь при комнатной температуре.

Перед опытом 0,7% МПА расплавляют и разливают по 2,5 мл в пробирки, охлаждают до 46-47^°С и затем добавляют в пробирки по 1 мл исследуемого фага (предварительно разведенного) и 0,1 мл эталонной культуры, все это быстро и тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, после чего выливают в чашки на поверхность 1,5% агара. Смесь осторожными движениями распределяют так, чтобы над слоем 1,5% агара образовался слои 0,7% агара, содержащего бактериофаг и чувствительную к нему культуру бактерий. Для застывания добавленного агара чашки оставляют на столе на 1-1,5 часа, а затем помещают в термостат при 37^°С. Для получения четких результатов необходимо соблюдение следующих условий: а) чашки с 1,5% агаром должны быть хорошо высушены; б) чашки должны находиться после добавления 0,7% агара строго в горизонтальном положении во избежание стекания агара в одну сторону; в) расплавленный 0,7% агар после охлаждения до 46°С нельзя долго хранить, так как он может приобрести гелеобразную консистенцию.

Учет результатов титрования можно производить после 5-6-часового инкубирования в термостате. Для этого подсчитывают количество колоний фага («стерильных» пятен) и умножают полученное число на фактор разведения. Например, при посеве 1 мл фага, разведенного в 10^-7 на чашке обнаружено 45 колоний, следовательно, титр фага равен 45×10⁷ = 4,5×10⁸ Зарисовать демонстрационный опыт титрования фага по Грациа.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е. соli 1ас^- добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культуры Е. соli 1ас⁺, в концентрации 10⁶-10⁷. Смесь инкубируют при 37^°С в течение часа, после чего 0,1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас⁺ (реципиент без фага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.

Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.

В качестве донора используется культура Е. coli Hfr с генотипом tre⁺, lei⁺, met^-, str^s (str^s– чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культура Е. coli F^–с генотипом tre^-, lei^-, met⁺, str^r (str^r - устойчивость к стрептомицину).

Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1,0 г; стрептомицина – 200 ед/мл; NH₄Cl – 1,0 г; NaС1 – 0,5 г; Na₂HРO₄ – 6,0 г; КH₂PO₄– 3,0 г; Mg₂SO₄– 0,2 г; дистиллированной воды – 1,0 л. Для тех же целей может быть использована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавляется 20,0 г агар-агара.

На этой среде могут расти только рекомбинанты (трансконъюганты). Культуры донорного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.

Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента добавляют 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0,1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.

Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину.

Каковы морфология, размеры и химический состав фагов?

Как устроен хвостик фага и каково его назначение?

Из каких этапов складывается взаимодействие фага с микробной клеткой?

Каким образом фаг вводит свою нуклеиновую кислоту в микробную клетку?

Как осуществляется синтез фаговых частиц внутри микробной клетки?

Какая разница между вирулентным и умеренным фагом?

Что такое лизогения и лизогенная конверсия?

Как выделяют фаги из объектов внешней среды?

Какова методика определения титра фага по Грациа?

Что такое фаготипирование? С какой целью оно применяется?

Что таков мутации спонтанные и индуцированные?

Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?

Что такое трансдукция и какими свойствами обладает трансдуцирующий фаг?

Что такое конъюгация бактерий? Как она осуществляется?

Какие существуют типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий?

В чем заключается механизм конъюгации бактерий?

Как определяют конъюгативные свойства плазмид?

В каких направлениях могут быть использованы достижения генной инженерии?

Ген – универсальная организующая структурная единица живой материи, которая благодаря содержащейся в ней закодированной информации обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию.

Ген – основной носитель и хранитель жизни, а его продукт – белок – способ её существования.

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычислить, когда этот...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: