|
|
ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКАСтр 1 из 2Следующая ⇒
Содержание Основные принципы приготовления препаратов для световой и электронной микроскопии, взятие материала (биопсия, игловая пункционная биопсия, аутопсия). Фиксация, обезвоживание, уплотнение объектов, приготовление срезов на микротомах и ультрамикротомах. Виды мипрепаратов - срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф. Окрашивание и контрастирование препаратов. Понятие о гистологических красителях. Понятие о гистохимия, радиоавтография, гостиной методы исследования. Использование иммуноцитохимии для идентификации и визуализации экспрессии молекул в клетках, тканях и органах. Количественные методы исследования. Контрольные вопросы 1. Методы гистологического исследования. 2. Основные принципы и этапы приготовления гистологических препаратов.
Методы, применяемые при гистологическом исследовании: 1. Прижизненные. 2. Посмертные. I ПРИЖИЗНЕННЫЕ МЕТОДЫ Целью прижизненных исследований является получение информации о жизнедеятельности клетки: движение, деление, рост, дифференцировка, взаимодействие клеток, продолжительность жизни, разрушение, реактивные изменения под действием различных факторов. Исследование живых клеток и тканей возможно вне организма (in vitro) или внутри организма (in vivo). А. Исследование живых клеток и тканей в культуре (in vitro) – метод культивирования Различают: а)суспензионные культуры (клетки, взвешенные в питательной среде), б)тканевые, в)органные, г)монослойные. Метод культивирования ткани вне организма является самым распространенным. Культивировать ткань можно в специальных прозрачных герметически закрытых камерах. В стерильных условиях в камеру помещают каплю питательной среды. Наилучшей питательной средой является плазма крови, к которой добавляют эмбриональный экстракт (вытяжка из тканей зародыша, содержащая большое количество веществ, стимулирующих рост). Туда же помещают кусочек органа или ткани (не более 1 мм3), которые необходимо культивировать. Выдерживать культивируемую ткань следует при температуре тела организма, ткань которого взята для исследования. Так как питательная среда быстро приходит в негодность (в ней накапливаются продукты распада, выделяемые культивируемой тканью), то каждые 3-5 дней ее нужно менять. Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток между собой, а также с вирусами и микробами. Культивирование эмбриональных тканей позволило изучить развитие кости, хряща, кожи и др. Особую значимость метод культивирования имеет для проведения экспериментальных наблюдений на клетках и тканях человека, в частности для определения пола, злокачественного перерождения, наследственных заболеваний и др.
Недостатки метода: 1. Главным недостатком этого метода является то, что ткань либо орган исследуется в отрыве от организма. Не испытывая нейрогуморального влияния организма, она теряет присущую ей дифференцировку. 2. Необходимость частых пересадок (при длительном культивировании). 3. Одинаковый коэффициент лучепреломления тканей.
Б. Прижизненное исследование клеток в организме (in vivo) 1. Наблюдение структур в живом организме. Пример:с помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюминаторов можно наблюдать циркуляцию крови в микрососудах. 2.Метод вживления прозрачных камер в организм животного. Исследуемый объект помещается в прозрачную камеру (снабженную микроотверстиями для осуществления обмена веществ) и вживляется, чаще всего, в ушную раковину экспериментального животного. С помощью микроскопа можно наблюдать динамику изменения клеток и тканей в течение длительного времени. 3.Метод использования естественных прозрачных камер экспериментального животного, например передней камеры глаза, расположенной между роговицей и радужкой. Такой метод был использован для изучения ранних стадий развития зародыша, циклических изменений эндометрия и др. 4. Метод трансплантации – широко используется для изучения кроветворения. Клетки крови и костного мозга от здоровых животных пересаживаются животным, подвергнувшимся смертельному облучению. Экспериментальные животные выживают вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток (метод колониеобразования). Этим методом установлены источники развития для всех клеток крови. Так как ткани в организме имеют приблизительно одинаковый коэффициент лучепреломления, то иногда с целью их дифференцировки прибегают к использованию прижизненных красителей. К прижизненным красителям относятся: метиленовый синий, трипановый синий, конго-красный. Прижизненные красители должны отвечать следующим требованиям: 1. Быть безвредными для организма. 2. Быстро выводиться из организма. Окрашивание живых объектов имеет две разновидности: 1. Витальное (прижизненное окрашивание) -краситель вводят в организм животного, где он избирательно связывается с определенными клетками, органеллами, межклеточным веществом… Например, трипановый синий или литиевый кармин выявляют фагоциты; ализарин – новообразованный матрикс кости. 2. Суправитальное окрашивание – окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом красителем бриллиантовым крезиловым синим выявляются молодые эритроциты (ретикулоциты), янусом зеленым – митохондрии, нейтральным красным – лизосомы.
II ПОСМЕРТНЫЕ МЕТОДЫ
Основным объектом посмертного метода исследования является гистологический препарат. Препарат может представлять собой: - мазок (крови, костного мозга, слюны…) - отпечаток (селезенки, печени, тимуса…) - пленку (брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки…) - срез - шлиф (зуба, кости…) Наиболее часто используют тонкие окрашенные срезы, заключенные в бальзам – так называемый постоянный гистологический препарат.
Приготовление постоянного гистологического препарата Основными этапами приготовления гистологических препаратов являются следующие: 1. Взятие материала. 2. Фиксация. 3. Промывка. 4. Обезвоживание. 5. Заделка в уплотняющие среды. 6. Приготовление срезов. 7. Окраска срезов. 8. Обезвоживание, просветление и заключение среза в канадский либо пихтовый бальзамы для длительного хранения.
1. Взятие материала для приготовления препарата от живого организма (биопсия) или от трупа (аутопсия). Объект не должен превышать 1 см3. 2. Фиксацию объекта производят с целью сохранения структуры ткани либо органа, частичного уплотнения и предохранения от порчи. Учитывая выше изложенное, фиксаторы должны отвечать следующим требованиям: а) не должны изменять структуры объекта, б) должны свертывать белки, в) быть бактерицидными. Фиксаторы различают простые и сложные. К простым относятся однокомпонентные: формалин (раствор формальдегида в воде), алкоголь, сулема и др. К сложным фиксаторам относятся фиксаторы, состоящие из нескольких компонентов. Например: 1. Ценкер-формоловая смесь (сулема, формалин, бихромат калия, вода, сернокислый натрий). Каждый компонент этой смеси улучшает качество другого. Например: сулема является очень хорошим фиксатором, но плохо пропитывает ткани; бихромат калия, наоборот, слабый фиксатор, но зато хорошо пропитывает ткани. В сочетании они дополняют друг друга. 2. Жидкость Карнуа (спирт, формалин, ледяная уксусная кислота). Время фиксации зависит от вида фиксатора, вида и размера объекта и от целей, которые преследует исследователь. Варьирует оно от нескольких минут до нескольких дней и даже месяцев.
3. Промывка делается с целью освобождения от фиксатора. Производят ее в проточной воде (до 1 суток).
4. Обезвоживание производят в спиртах возрастающей крепости (от 60 до 100 градусов), чтобы предохранить ткань от быстрого сморщивания. 100 градусный спирт называется абсолютным. Абсолютная концентрация спирта достигается добавлением к 96-спирту влагопоглотителей: прокаленного медного купороса или окиси кальция.
5. Заделка в уплотняющие среды. После обезвоживания производят заделку объекта в уплотняющие среды. Такими средами являются парафин, целлоидин. Заделка в парафин. Парафин – это твердое вещество - жировоск. Предварительно объект из абсолютного спирта переносят в смесь спирта с каким-либо жирорастворителем (ксилол, хлороформ) в соотношении 1:1, а затем в порцию чистого жирорастворителя. После этого объект помещают в насыщенный раствор парафина в жирорастворителе с температурой плавления 37 градусов, называемый в гистологической практике снегоподобной массой. В этом растворе объект следует выдержать до 1 суток. Затем объект на несколько часов последовательно переносят в 2 порции чистого парафина с температурой плавления 54-56 градусов (в термостате). После того как объект достаточно пропитался парафином, формируют парафиновый блок путем заливки объекта чистой порцией парафина в специальной формочке с последующим быстрым охлаждением. а) парафиновая заливка дает возможность получить тонкие равномерные срезы (2-7 мкм); б) парафиновая заливка дает возможность получить серию срезов, что необходимо для послойного изучения объекта.
6. Приготовление срезов производят на специальных приборах – микротомах. Различают микротомы: а) санные, б) швейные (ротационные). В санном микротоме блок укрепляется неподвижно в объектодержателе, а микротомный нож, проходя над ним, делает срезы. В микротоме есть микрометрический винт, соединенный с объектодержателем. Каждый поворот винта вызывает соответственное перемещение вверх объектодержателя с объектом на заданное расстояние (заданная толщина среза). В швейном микротоме, наоборот, микротомный нож закреплен неподвижно, а объектодержатель с объектом подвижно. Полученные парафиновые срезы наклеивают на предметное стекло с помощью яичного белка или легкого подогревания на спиртовке или в термостате.
7. Окраска срезов. Окрашивание срезов производится с целью увеличения контрастности изучаемых структур. Для этого срезы необходимо депарафинировать: удалить парафин погружением стекол в ксилол, а затем избавиться от ксилола последовательной промывкой в спирте и воде. Краска наносится на срез на несколько минут, затем смывается водой. Обычно используется комбинированная окраска с использованием двух или нескольких красителей, избирательно окрашивающих различные структуры, например: гематоксилин (ядра) + эозин (цитоплазма). 8. Заключение объекта для длительного хранения. После окрашивания срезы промывают водой, обезвоживают спиртом, спирт удаляют ксилолом, который одновременно делает срезы прозрачными. Затем на срезы наносится капля канадского либо пихтового бальзама, после чего он покрывается покровным стеклом и подсушивается. Такие постоянные гистологические препараты могут храниться в течение длительного времени. Особенности приготовления замороженных срезов Обычная гистологическая заливка длится около 7 суток, но в некоторых случаях требуется быстрая, немедленная диагностика препарата (cito!). В таких случаях используется метод заморозки. Изъятую, но нефиксированную ткань замораживают в специальных камерах – криостатах. С помощью воды формируется ледяной блок (аналог парафинового). В криостатную камеру вмонтирован микротом, с помощью которого изготавливают замороженные срезы. При комнатной температуре они оттаивают и пригодны для немедленной гистологической окраски. Такой метод позволяет оценить структуру препарата в течение нескольких минут – до получаса. Однако метод имеет существенный недостаток: в процессе замораживания в ткани образуются кристаллы льда, нарушающие прижизненную структуру (искажение структуры или изображения носит название – артефакт). Особенности приготовления материала для электронномикроскопического исследования Особенности обусловлены субмикроскопическим и молекулярным уровнем исследования. Обычные фиксаторы вызывают грубую коагуляцию белков, что на электронномикроскопическом (ЭМ) уровне вызвало бы появление артефактов. Поэтому в ЭМ используют фиксаторы глютаральдегид или четырехокись осмия – вызывающие тонкую, нежную коагуляцию белков. В качестве уплотняющих сред используют эпоксидные смолы. Приготовление ультратонких срезов (нм) производят на специальных приборах ультрамикротомах с помощью стеклянных или алмазных ножей. Гистологические красители Существует несколько классификаций красителей. По происхождению красители бывают растительными, животными, минеральными. По химическим свойствам – кислыми, основными, нейтральными. Наибольшее прикладное значение имеет классификация красителей по назначению. В соответствии с этой классификацией все красители подразделяются на две группы: I Прижизненные (см. выше) - трипановый синий - янус зеленый - метиленовый синий - конго красный II Посмертные Посмертные красители делятся на 2 вида: 1. Общие 2. Специальные 1. Общиекрасители в свою очередь делят на а) ядерные (основные),   Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...  Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...  Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...  ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры... Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:
|