Ферментация (культивирование)

Культивирование – самый важный и продолжительный этап биотехнологического производства. Ферментация представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение ценных веществ (метаболитов), возникающих в ходе роста или на последующих стадиях развития культуры.

Для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах применяют ферментеры (или ферментаторы) – реакционные емкости, в которых при определенных условиях находятся микроорганизмы. Основное назначение ферментатора – своевременно обеспечить микробные клетки необходимыми питательными веществами и кислородом (при необходимости) и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабого потока культуральной жидкости (при непрерывном культивировании).

В независимости от способа культивирования перед заполнением ферментаторов средой их моют, проверяют на герметичность, стерилизуют горячим паром как сам ферментатор, так и систему трубопроводов. Для обеспечения стерильности ферментатора часто применяют предварительную обработку его химическими дезинфицирующими веществами (этот процесс проводят непосредственно перед обработкой горячим паром). После этого его заполняют стерильной охлажденной питательной средой. Количество среды в ферментаторе не должно превышать 70 % его общего объема. Затем по линии посевного материала с помощью стерильного воздуха в ферментатор вводят посевной материал. Уже перед его подачей температура и рН питательной среды должны быть доведены до оптимальных значений для данной культуры. Соответственно регулируют интенсивность аэрации и перемешивания среды. В пространстве над жидкостью обычно скапливается пена. Если ее слой сильно увеличивается, то в аппарат вводятся химические пеногасители. Во время ферментации автоматически регулируется температура и рН среды, в случае необходимости добавляют растворы кислоты или щелочи. По специальному графику берут образцы жидкости из ферментатора для биохимического и микробиологического контроля.

Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максимальное количество полезного продукта. Конец ферментации можно определить и микробиологически по морфологическим изменениям клеток продуцента.

Окончив ферментацию, культуральную жидкость охлаждают до 10 –15 °С и перекачивают в резервуары, из которых она постепенно подается на дальнейшую обработку.

Стадия выделения продукта существенно зависит от того, накапливается продукт в клетках или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Разделение биомассы и культуральной жидкости – сепарация – осуществляется несколькими методами.

Выделение биомассы. Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы).

Фильтрация – простой и широко применяемый процесс разделения твердых частиц и жидкости, скорость которого зависит от пористости фильтрующего материала и давления. Фильтрование при помощи вакуумных насосов существенно ускоряет процесс.

Флотирование применимо для выделения дрожжевых клеток. Процесс флотирования клеток осуществляется путем вспенивания культуральной жидкости. Вместе с пеной из культуральной жидкости удаляется и основная масса дрожжей.

Сепарирование осуществляют в сепараторах, в которых на клетки действует центробежная сила, отбрасывающая клетки к периферии сосуда, а культуральная жидкость будет собираться в центре сепаратора. Этот процесс протекает гораздо быстрее, чем отстаивание клеток под действием силы тяжести.

Извлечение целевого продукта из клеток. Если целевой продукт содержится в самих клетках, то проводят разрушение клеток – дезинтеграцию – физическими, химическими и ферментативными методами.

К физическим методам можно отнести разрушение клеток под действие ультразвука, замораживания-оттаивания, баллистическую дезинтеграцию. Баллистическая дезинтеграция клеток осуществляется в мельницах, куда помещают суспензию клеток и вспомогательные мелющие вещества: песок, стеклянные или полимерные шарики.

К химическим методам дезинтеграции относят разрушение клеток с помощью толуола, бутанола и других химических соединений.

При использовании ферментативной дезинтеграции клеток используют ферменты, способные разрушать определенные структурные компоненты клеточных стенок микроорганизмов. Например, для разрушения бактериальных клеток применяют лизоцимы яиц, бактерий, актиномицетов или грибов. Для разрушения дрожжей и плесневых грибов используются фосфоманназа и бета-глюконаза или применяют автолиз. Автолиз – разрушение клеток дрожжей или плесневых грибов под действием собственных гидролитических ферментов. Для этого суспензию клеток инкубируют при 35 – 45 ˚С.

Выделение продукта из культуральной жидкостиили гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции, кристаллизации или сорбции.

В наиболее простом случае всю культуральную жидкость можно использовать как готовый продукт, например при получении бактериальных удобрений, если их применяют в жидком виде. В спиртовой промышленности амилолитические ферменты плесневых грибов иногда используют в жидком виде. При производстве витаминных и аминокислотных концентратов для нужд животноводства иногда используются все продукты ферментации. В таких случаях культуральную жидкость упаривают в вакуум-аппаратах и сушат в сушилках распылительного типа.

Осаждение в виде нерастворимых солей производят путем добавления химического осадителя в эквимолярных количествах. Применяют при получении лимонной, молочной кислоты.

Экстракция – добавление к раствору экстрагента (растворителя), который поглощает целевой продукт. Затем эмульсию разделяют и выделяют целевое вещество. Используют при получении витаминов, антибиотиков.

Кристаллизация – после предварительной обработки культуральной жидкости и выпаривания при охлаждении осуществляют кристаллизацию. Данный метод выделения и очистки используется при получении глутаминовой, итаконовой и других кислот.

Затем выделенный продукт концентрируют центрифугированием, ультрафильтрацией, выпариванием или обратным осмосом.

Центрифугирование – расслоение раствора с частицами бόльшей плотности на осадок и надосадочную жидкость при воздействии центробежной силы.

Ультрафильтрация – обработка раствора на мембранных фильтрах с определенным размером пор (то есть разделение веществ на фракции по размерам их молекул). Применяется для ферментов и других белков.

Эта стадия необходима при получении очищенного целевого продукта, например, ферментных препаратов степени очистки более двухкратной. Эта стадия приводит к росту себестоимости получаемого целевого продукта. Для проведения процессов ионообмена, перегонки, ректификации, выпаривания, кристаллизации и других в микробиологическом производстве применяют оборудование химической технологии.

Для очистки ферментов применяют избирательную сорбцию (связывание) каолином, трифосфатом кальция, гидроксидом алюминия и другими адсорбентами. Таким образом проводят сорбцию либо фермента, либо балластных белков, которые затем разделяют центрифугированием. Фермент из сорбента отделяют раствором фосфатного буфера.

На последнем этапе продукт отделяют от примесей, концентрируют и стабилизируют. После стабилизации продукта в зависимости от того, каким должен быть конечный продукт: сухим или жидким, его обезвоживают или сразу упаковывают и отправляют на хранение и далее – потребителю.

1. Перечислите основные стадии биотехнологического производства.

3. Как готовят посевной материал в производственных условиях?

4. Какие компоненты входят в состав питательных сред?

6. Какими методами осуществляется разделение биомассы от культуральной жидкости?

7. Перечислите основные стадии биотехнологической схемы получения продуктов микробного синтеза.

8. Как определить физиологические потребности микроорганизмов в питательных веществах?

9. Какие методы применяют для обеззараживания питательных сред в биотехнологическом производстве?

10. Опишите последовательность получения посевного материала для промышленного производства целевого продукта.

12. От чего зависит проведение стадии выделения целевого продукта?

13. Какие методы применяют для отделения биомассы клеток от культуральной жидкости?

14. Что такое дезинтеграция, в каких случаях ее осуществляют?

15. Расскажите об основных методах дезинтеграции клеток.

16. В чем отличие сепарирования от центрифугирования?

17. В каких случаях выполняется стадия очистки целевого продукта?

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: