Сдам Сам

ПОЛЕЗНОЕ


КАТЕГОРИИ







Работа выполнена в ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России»





 

Научный руководитель: кандидат медицинских наук

Болдырева М.Н.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ярилин А.А.

Доктор медицинских наук, профессор

Бубнова Л.Н.

Ведущая организация:Российский государственный медицинский университет Росздрава

 

 

Защита состоится “ 28 февраля 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп. 2. Факс: (095) 117-10-27.

 

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России».

 

Автореферат разослан “ 26 января 2007 года.

 

 

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Л.С. Сеславина

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации: Комплекс генов HLA (главного комплекса гистосовместимости человека) компактно расположен на коротком плече 6-й аутосомной хромосомы, занимает 3500 kb (тысяч пар оснований) и содержит более 220 генов [Robinson J., Matthew J., 2001]. В состав HLA входят три группы генов: экспрессирующиеся гены, псевдогены и гены с неустановленной функцией [Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы]. Гены локуса HLA -DP, -DQ и –DR, ближайшие к центромере, кодируют молекулы II класса. Молекулы II класса определяются на поверхности так называемых антиген-представляющих (вспомогательных) клеток - дендритных, активированных макрофагов, В-лимфоцитов, а также активированных эндотелиальных, эпителиальных и тучных клеток, Т-хелперов [Ярилин А.А., 1999].

Система HLA является одной из наиболее полиморфных генетических систем, выполняющей в организме человека ряд функций, важнейшими из которых являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание иммунного гомеостаза, нарушение которого лежит в основе таких патологических процессов, как аутоиммунные заболевания и развитие опухолей [Акопян А.В., Алексеев Л.П, 1998]. Обеспечивая регуляцию иммунного ответа, гены HLA осуществляют генетический контроль взаимодействия всех иммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих и чужеродных (в том числе измененных собственных) клеток, запуск и реализацию иммунного ответа и, в целом, обеспечивают выживание человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии [Хаитов Р.М., 2005]. Эти функции, в первую очередь, обусловлены двумя свойствами системы HLA: участием в презентации антигенного пептида и широким разнообразием – полиморфизмом аллельных вариантов каждого гена.

Для «запуска» адаптивного иммунного ответа на патоген, его антигенный пептид для распознавания Т-хелпером должен быть представлен антиген-представляющей клеткой только в контексте с молекулой HLA II класса [Dogerty P.C., Zinkernagel R.M, 1975].

Несмотря на мощное действие направленного отбора, полиморфизм системы HLA сохраняется и является необходимым элементом при взаимодействии человека с окружающей средой. Каждый из аллелей генов HLA обеспечивает возможность реагировать на определенный набор пептидов антигенов, и индивидуумы, которые гетерозиготны по HLA, могут иметь эффективный иммунный ответ на более разнообразный спектр антигенов и имеют намного больше шансов противостоять инфекции, что способствует поддержанию HLA-разнообразия на высоком уровне.

Исследование полиморфизма системы HLA является одним из наиболее эффективных подходов к изучению структуры и функции главного комплекса гистосовместимости человека. Необходимость подобных исследований обусловлена, в том числе и тем фактом, что без полного представления о строении системы генов тканевой совместимости невозможно успешное развитие клинической трансплантологии, и в первую очередь, это касается пересадки аллогенного костного мозга.

Для изучения полиморфизма системы HLA класса II используется, в основном, анализ особенностей распределения DRB1 гена. Объяснением этого факта может служить значительно более выраженный полиморфизм гена DRB1, по сравнению с DQA1 и DQB1 генами. Гаплотипичесие сочетания DRB1-DQA1-DQB1, вследствие их еще большей вариабельности, лучше отражают разнообразие HLA-системы.

В последние 25 лет появилась возможность исследования HLA на качественно новом молекулярно-генетическом уровне при помощи полимеразной цепной реакции. Принципиальным отличием новых методов явилось использование в качестве объекта исследования непосредственно генетического материала (участков ДНК, определяющих аллельный полиморфизм системы HLA) [Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., 2000]. Результатом этого стало заметное увеличение количества известных специфичностей HLA - со 150 в 1991 году [Tsuji K., Aizava M., 1992], 472 в 1998 году [Bodmer J.G., Marsh S.G., 1999] до примерно 2500 (данные на 2006 год) аллелей [Marsh S.G.E., 2006]. При этом среди вновь открытых аллелей установлены аллели чрезвычайно выраженной ассоциации с заболеваниями [Cotton R., 1989].

Исследования полиморфизма HLA в различных этнических группах позволяют обнаруживать все новые аллельные варианты генов HLA. В последние годы благодаря распространению в России молекулярно–генетических методов изучения HLA появилась возможность исследования аллельного разнообразия генов HLA в разных этнических группах, в том числе славянских, проживающих как на территории России, так и вне ее.

Данные, полученные в результате изучения распределения генов II класса главного комплекса гистосовместимости в различных этнических группах, могут быть использованы для развития клинической трансплантологии, направления “HLA и болезни”, криминалистики (идентификация личности) и такой фундаментальной науки, как антропология, поэтому представлялось целесообразным проведение исследования, посвященного изучению HLA–разнообразия в популяциях, принадлежащих к различным этническим группам, на современном молекулярно–генетическом уровне.

Цель работы: Изучить полиморфизм специфичностей генов HLA II класса (DRB1, DQA1 и DQB1) и их гаплотипических сочетаний в трёх различных восточнославянских этнографических популяциях: русской, белоруской и украинской с помощью ранее созданных в ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» вариантов ДНК-типирования (выделение геномной ДНК из периферической крови, типирование генов HLA класса II методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле) с целью последующего использования полученных данных для развития фундаментальной биологической науки (антропология и иммуногенетика) и для прикладной медицины (клиническая трансплантология, «HLA и болезни»).

Задачи исследования:

1. Провести анализ распределения специфичностей HLA- DRB1, DQA1 и DQB1, а также их гаплотических сочетаний у здоровых представителей русской, белоруской и украинской популяций в сравнении с аналогичными данными для других популяционных групп.

2. Проанализировать генетическое родство исследованных популяций, как между собой, так и с некоторыми народами Европы.

3. На примере восточных славян изучить способность системы генов HLA отражать геногеографию этнических групп и возможность использования этой системы в популяционных исследованиях.

Научная новизна: В процессе работы впервые был проведен сравнительный анализ особенностей распределения специфичностей генов HLA II класса (DRB1, DQA1 и DQB1) и их гаплотипических сочетаний на молекулярно–генетическом уровне среди представителей белорусских, украинских и русской популяций.

На основе полученных данных был проведен расчет генетических расстояний, что позволило оценить генетическое родство между исследованными этническими группами:

Оценено генетическое родство (по профилю распределения гена DRB1) исследованных популяций с некоторыми народами Европы и выявлены межпопуляционные различия.

Впервые на примере восточных славян, показано, что, несмотря на влияние направленного естественного отбора, распределение генов HLA II класса адекватно отражает геногеографию этнических групп, и особенности полиморфизма генов HLA могут быть использованы в популяционных исследованиях.

Впервые получены данные по распределению генов HLA II класса для восточнославянских популяций, которые могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний, для идентификации личности в судебной медицине.

Практическая значимость работы:

1. Данные о распределении специфичностей генов HLA II класса и их сочетаний у здоровых представителей белорусских, украинских и русской популяций могут быть использованы в качестве контрольных для поиска маркеров генетической предрасположенности к развитию различных заболеваний.

2. Полученные данные служат теоретической базой для практических рекомендаций в клинической трансплантологии по поиску доноров аллогенного костного мозга в пределах генетически близких популяционных групп.

3. Популяционные данные могут быть использованы в судебно-медицинской практике для идентификации личности.

4. Полученные данные могут быть использованы для изучения истории формирования таких генетически близких народов, как восточные славяне.

Публикации: Материалы диссертации опубликованы в 4 научных публикациях, изданных в России.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 117 источников. Работа содержит 21 таблицу и 19 рисунков.

 

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Для исследования были использованы образцы крови взрослых здоровых и неродственных между собой представителей пяти популяций, представляющих три восточнославянских этноса: две популяции белорусов (Витебская и Брестская области), две популяции украинцев (Львовская и Хмельницкая области) и русская популяция (Вологодская область).

Места обследования планировались так, чтобы изученные популяции дали представление о важнейших подразделениях генофонда каждого народа. Среди белорусов антропологи выделяют две важнейших группы – северных (представленных у нас выборкой из Витебской области) и южных (представленных у нас выборкой из Брестской области). Брестская популяция представляет белорусское Полесье. Антропологическое подразделение украинского этноса, в отличие от белорусского следует не по оси «север-юг», а по оси «запад-восток». В соответствии с этим нами были обследованы популяции, представляющие западный вариант антропологического типа украинцев (Львовская область) и восточный вариант (Хмельницкая область). Русская популяция представлена населением Вологодской области, которое, относясь в целом к северному варианту русского генофонда, в течение многих веков впитывало в себя и генные потоки из среднерусской полосы.

Каждая из пяти популяций представлена только коренным сельским населением, относящимся к целому ряду населенных пунктов и потому репрезентативно представляющим данную часть этнического ареала. В выборку включались только те неродственные между собой индивиды, все бабушки и дедушки которых относятся к данному этносу и родились в пределах данной популяции.

 

Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови.

Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi, H.Erlich, 1989) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой на EDTA в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течении 1 мин. при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 2,5мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37°С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К кипячением в течение 5 минут в водяной бане. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при -20°С.

Концентрация ДНК определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем 50-100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 минут.

Полимеразная цепная реакция. Амплификация выделенной ДНК.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, и дГТФ), 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl, 50 мМ NaCl, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Концентрацию праймеров подбирали отдельно для каждой смеси. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" (НПФ "ДНК-Технология", Москва).

Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRB_sen и DRB_al), а во второй – пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR*03, DR*05, DR*06, DR*08 (праймеры DRB_38ns и DRB_al). В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера «МС-2», запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, быстрого (“fast”) регулирования) был следующим:

1. 94°C – 1 мин.

2. 94°С – 20 сек. 7 циклов

67°С – 2 сек.

3. 93°С – 2 сек. 28 циклов

65°С – 4 сек.

Полученные продукты разводили в 10 раз и использовали на втором раунде.

При амплификации на втором раунде использовали следующий температурный режим (для термоциклера типа «МС-2», запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, точного(“precise”) регулирования):

1. 93°С - 5 сек. 15 циклов

64°С - 10 сек.

Типирование локуса DQA1 проводилось в два этапа. На первом раунде использовалась пара праймеров, амплифицирующая все специфичности локуса DQA1, а на втором раунде – пары праймеров, амплифицирующие специфичности *0101, *0102, *0103, *0201, *0301, *0401, *0501, *0601. Для проведения амплификации использовали программу, приведенную для амплификатора типа МС2, запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, быстрого (“fast”) регулирования:

1. 94°С - 1 мин.

2. 94°С - 20 сек. 7 циклов

58°С - 5 сек.

3. 92°С - 5 сек. 28 циклов.

56°С - 10 сек.

Продукты амплификации первого раунда разводили в 10 раз и использовали на втором раунде по следующей программе в режиме активного, точного(“precise”) регулирования:

1. 93ºС - 5 сек. 12 циклов

62ºС - 10 сек.

Типирование локуса DQB1 также проводилось в два этапа. На первом раунде использовали пару праймеров, амплифицирующую все специфичности локуса DQB1. Температурный режим был следующий:

 

1. 94ºС - 1 мин.

2. 94ºС - 20 сек. 7 циклов

67ºС - 5 сек.

3. 93ºС - 1 сек. 28 циклов

65ºС - 2 сек.

На втором раунде использовали пары праймеров, амплифицирующих следующие специфичности: *0201, *0301. *0302, *0303, *0304, *0305, *0401/02, *0501, *0502/04, *0503, *0601, *0602/08; продукты первого раунда разводили в 10 раз и проводили амплификацию в следующем температурном режиме:

 

1. 93ºС – 1 сек. 12 циклов

67ºС – 2 сек.

Проведение электрофореза.

В каждую из лунок 3% агарозного геля под буфер отдельным наконечником вносят по 5 мкл окрашенного амплификата.

Электрофорез проводят при напряжении 200-250V.

Время проведения электрофореза: после окончания I этапа - 10 минут,

после окончания II этапа - 20 минут

После проведения электрофореза гель вынимали из прибора для электрофореза и просматривали на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Окрашивание геля проводили бромистым этидием. Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.

Статистическая обработка результатов.

Для определения частоты аллелейи трехлокусных гаплотипов методом максимального правдоподобия (maximum-liekelihood) использовали компьютерную программу «Арлекин», версия 2.1 (URL:http://anthro.unige.ch/arlequin)

Анализ генетических расстояний проводили с помощью компьютерных программ «DJgenetic» (расчет расстояний Нея) [Ю.Серегин и соавт.,1998г.] и «Statistica 6.0» (построение дендрогамм и графиков многомерного шкалирования по двум осям на основе полученных данных) [StatSoft,2001г.].

Сравнение частот специфичностей и трехлокусных гаплотипов в исследованных популяциях проводилось с использованием точного критерия Фишера [Животовский Л.А., 1991г.]. Корректировка на количество аллелей проводилась с помощью коэффициента Бонферонни [Вейр Б., 1995г.].

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

 







ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...





Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:


©2015- 2022 zdamsam.ru Размещенные материалы защищены законодательством РФ.