Ферменты генетической инженерии.

Ферменты генетической инженерии.

Ферменты генетической инженерии – ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д. основные ферменты: I группа. ДНК-полимеразы. Функции: 1Построение второй комплиментарной цепи.2Применяется для заполнения бреши в цепи ДНК.3Используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК.4Используется термостабильная ДНК–полимеразы.5Применяется при ПЦР (полимеразная цепная реакция).

IIгр. ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соединениями нуклеотидами. С помощью лигазы Т4 соединяют любые фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми».

IIIгр Нуклеазы– большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Различают ДНК-нуклеазы, РНК-нуклеазы, рестриктазы – специфические эндонуклеазы.В генной инженерии наиболее широко используются около 200 рестриктаз.Рестриктазы могут указывать короткую нуклеотидную последовательность из 4-6 нуклеотидных пар и разрывать межнуклеотидные связи только в этом месте.

Конструирование рекомбинантных ДНК.

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.

Рекомбинантная ДНК–искусственно полученная ДНК. Фрагменты ДНК, получают при помощи рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты с тупыми, и с липкими концами.

Последовательность генно-инженерных процессов.

1Получение гена.

2Встраивание гена в векторы и их размножение – клонирование.

3Перенос гена в клетки реципиентов.

4Склиринг – отбор бактерий или клеток в которые встроился ген.

5Встраивание гена в ДНК реципиента и его экспрессия).

6Вылавливание генных продуктов из «грязной» смеси.

Получение генов.Ген можно получить двумя методами:

1.Рестрикционный, 2. Синтез генов: химический,ферментативный, химико-ферментативный. 1впервые синтезировали химическим путем алланиновой т-РНК, ген включал 77 пар нуклеотидов. Ученые синтезировали нуклеотиды, затем соединяли их между собой при помощи ферментов – лигазы.Ген при введении к клетку кишечной палочки работать не стал, т.к. не имел регуляторных участков (промотора, ферментатора).В 1976 г Корана с сотрудниками осуществил синтез гена супрессорной–теразиновой т-РНК, также они синтезировали промотер, терминатор с концами присоединили тетро-нуклеотиды А-А-Т-Т–ТТАА в этом случае ген начал работать.2Ферментативный синтез. В 1970 г Темин с сотрудниками обнаружил фермент у онкогенных вирусов – обратная транскрептаза или ДНК-ревертаза.С помощью ДНК-зонда отыскивают нужную и-РНК и при помощи обратной транскриптазы синтезируют на ней комплиментарную цепочку ДНК, а затем при помощи ДНК-полимеразы двойную цепочку ДНК.3. Химико-ферментативный синтез – сам ген синтезируется ферментативным путем, а все регуляторные элементы (олигонуклеотиды) – проймеры, линкеры, адапторы, промотеры – синтезируются химическим путем.

Последовательность генно-инженерных процессов.

Последовательность генно-инженерных процессов.

1. Получение гена.

2. Встраивание гена в векторы и их размножение – клонирование.

3. Перенос гена в клетки реципиентов.

4. Склиринг – отбор бактерий или клеток в которые встроился ген.

5. Встраивание гена в ДНК реципиента и его экспрессия (функционирование).

6. Вылавливание генных продуктов из «грязной» смеси.

43.Методы получения генов.

Рестрикционный

Синтез:-Химическ.-ферментативный.-химико-ферментатив.

Рестрикционный метод,получение генов с помощью специфических эндонуклеаз - рестриктаз. С помощью рестриктаз расщепляют ДНК бактерий другого штамма или клетки-хозяина.

Рестриктазы гидролизируют ДНК по определенным последовательностям, называемым сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК.Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться др. с другом с помощью ДНК-лигазы,сайт рестрикции восстанавливается. рестриктазы не «выстригают» полностью ген и его нужно либо достраивать химическим путем, либо отщеплять лишние нуклеотидные последовательности.

Химический. Расшифровав последовательность аминокислот в белке, и используя генетический код,определяют последов-сть нуклеотидов ДНК на участке гена и производят его синтез из нуклеотидов при помощи фермента полимераза-1.

Ферментативный синтез возможен после открытия фермента обратной транскриптазы или ДНК-ревертазы, выделенной из онкогенных вирусов. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК (к-ДНК) на РНК-матрице.

Химико-ферментативный синтез. Химическим путем синтезируют олигонуклеотиды:линкеры, адаптеры, праймеры, промоторы, а гены синтезируют ферментативным методом. Линкеры -короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания д.ряда рестриктаз. Адаптеры -линкеры, содержащие более одного сайта узнавания рестриктазой, он предназ. д.соединения фрагментов с несовместимыми концами. Праймеры -короткие одноцепочечные фрагменты, комплементарные началу или концу гена. Промотор -фрагмент ДНК, узнаваемый РНК-полимеразой.

44.Химический синтез гена. Кто и когда осуществил его впервые? Химический синтез. Расшифровав последовательность аминокислот в белке, и используя генетический код, определяют последовательность нуклеотидов ДНК на участке гена и производят его синтез из нуклеотидов при помощи фермента полимераза-1. в 1969 г. Корана впервые синтезировал участок молекулы ДНК, кодирующий аланиновую т-РНК, а в 1977 г. Бойер синтезировал ген соматостатина человека, а затем и ген инсулина.В 1977г. В. Гилбертом,Ф. Сэнгером был предложен метод секвенирования, т.е. распознавания последовательности нуклеотидов в фрагментах нуклеиновых кислот. Метод химического синтеза генов оказался трудоемким и малоэффективным. Затем появились быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной, последовательностью нуклеотидов. Теперь легко синтезировать последовательность до 100 нуклеотидов.

Ферменты генетической инженерии.

Ферменты генетической инженерии – ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д. основные ферменты: I группа. ДНК-полимеразы. Функции: 1Построение второй комплиментарной цепи.2Применяется для заполнения бреши в цепи ДНК.3Используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК.4Используется термостабильная ДНК–полимеразы.5Применяется при ПЦР (полимеразная цепная реакция).

IIгр. ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соединениями нуклеотидами. С помощью лигазы Т4 соединяют любые фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми».

IIIгр Нуклеазы– большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Различают ДНК-нуклеазы, РНК-нуклеазы, рестриктазы – специфические эндонуклеазы.В генной инженерии наиболее широко используются около 200 рестриктаз.Рестриктазы могут указывать короткую нуклеотидную последовательность из 4-6 нуклеотидных пар и разрывать межнуклеотидные связи только в этом месте.

ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: