Сдам Сам

ПОЛЕЗНОЕ


КАТЕГОРИИ







Характеристика фізико-хімічних методів дослідження





У біохімії широкого застосування набули діаліз, центрифугування, оптичні та електрохімічні методи, різні види хроматографії, радіоімунні дослідження тощо.

Центрифугування.Суть процесу центрифугування полягає в розділенні неоднорідних систем (суспензій, емульсій) у полі дії доцентрових сил. Під дією цих сил суспензії розділяються на тверду фазу – осад і рідку – центрифугат, який називають також супернатантом, або надосадовою рідиною. Значну роздільну здатність має так зване центрифугування в градієнті густини. У цьому разі частинки речовини в процесі центрифугування розділяються вздовж градієнта у вигляді дискретних зон або полюсів.

Залежно від фактора розділення (характеризує відношення прискорення доцентрових сил до прискорення сили тяжіння) центрифуги умовно поділяють на звичайні (G – до 3500) і ультрацентрифуги (G – понад 3500, відцентрове прискорення G = ώ2·R, де ώ – кутова швидкість (рад/сек.); R – радіус ротора (см)). Звичайні центрифуги використовують з метою препаративного центрифугування. Ультрацентрифуги дають змогу розвинути доцентрове прискорення поля до 300 000 G. Вони використовуються з аналітичною метою, для визначення молекулярної маси речовин та виділення їх окремих фракцій з розчинів.

Дооптичних методівдослідження належать: фотоелектроколориметричні, спектрофотометричні, флюоресцентний та ін.

Серед сучасних методів дослідження перевагу віддають спектральному аналізу. Він належить до фізико-хімічних методів якісного й кількісного визначення атомного та молекулярного складу речовин. Ці методи грунтуються на дослідженні спектрів, що поглинаються або випромінюються аналізованими речовинами. В основу цих методів покладено принцип вимірювання зміни інтенсивності світлового потоку. Залежно від довжини хвилі змінюється характер випромінювання, тому електромагнітний спектр поділено на зони: g– і космічні промені з довжиною хвилі 0,1 – 9 нм, ультрафіолетова зона – 100 – 380 нм, видима зона – 380 – 760 нм, інфрачервона зона – 760 – 1100 нм.



Серед спектральних методів дослідження виділяють абсорбційні та імерсійні. Абсорбційна спектроскопія полягає у вимірюванні поглинання світла, що проходить крізь досліджуваний розчин унаслідок абсорбції його речовиною, яку визначають. Кожна речовина поглинає світло певної довжини хвилі, отже, абсорбція світла вибіркова.

Фотометричні методиоптичного фізико-хімічного аналізу поділяють на дві групи: абсорбційну та емісійну фотометрію.

Абсорбційна фотометрія – це метод, що грунтується на встановленні ступеня послаблення монохроматичного світлового потоку внаслідок вибіркового поглинання світла розчиненою речовиною. Основним законом фотометрії є закон Ламберта – Бера, що формулюється таким чином: логарифм відношення інтенсивності світлового потоку, що проходить через розчин до інтенсивності світлового потоку, що виходить з розчину, прямо пропорційний концентрації речовини і товщині поглинального шару.

До методів абсорбційної фотометрії належать спектрофотометрія і нефелометрія.

Спектрофотометрія, або в ширшому розумінні колориметрія – це визначення інтенсивності забарвлення розчину досліджуваної речовини відносно інтенсивності забарвлення еталонного розчину з точно відомою концентрацією.

Фотоколориметрія – це вимірювання поглинання видимої частини спектра забарвленими розчинами.

Власне спектрофотометрія – це вимірювання поглинання (і пропускання) прозорих розчинів в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній зонах спектра (220 – 1100 нм).

Прилади, якими вимірюють світлопоглинання речовин, називаються абсорціометрами. До них належать фотоелектроколориметри і спектрофотометри. Фотоелектроколориметри дають змогу проводити вимірювання у видимій частині спектра. За допомогою спектрофотометрів проводять вимірювання в широкому діапазоні хвиль від ультрафіолетового до інфрачервоного (210 – 1100 нм) і досліджують забарвлені та безбарвні розчини у вузькій частині спектра, в зоні максимального поглинання монохроматичного потоку світла.

В основі абсорбційної спектроскопії – загальні принципи здатності речовин поглинати світлову енергію за законом Ламберта – Бера. Під час вимірювання інтенсивності поглинання світлового потоку користуються величиною, яка називається оптичною густиною розчину й позначається буквою А:

А = k · С · d, де С – концентрація (моль/л), d – товщина шару (см), k – молярний коефіцієнт поглинання (екстинкція). Цей коефіцієнт поглинання відповідає оптичній густині 1 М розчину за товщини шару в 1 см.

Нефелометрія –це метод аналізу, пов’язаний з оцінкою ступеня мутності досліджуваного розчину. Інтенсивність розсіювання залежить від розмірів частинок і кількості розчиненої речовини.

Емісійна фотометрія – грунтується на визначенні енергії, яка випромінюється досліджуваною речовиною в енергетично збудженому стані. До методів емісійної фотометрії відносять флюориметрію і полум’яну фотометрію.

Флюориметрія базується на ефекті флюоресценції, що дає енергетично збуджена досліджувана речовина під впливом короткохвильового опромінення.

Полум’янафотометрія полягає у використанні як енергетичного агента, що забезпечує стан збудження розчину досліджуваної речовини, полум’я газової горілки. Йони металів забарвлюють полум’я відповідно до характерних для них спектрів випромінювання. Щоб виділити випромінювання окремих йонів, застосовують спеціальні світлофільтри, після чого виконують всі необхідні вимірювання.

Явище холодного світіння деяких речовин, спричинене зміною електронного стану молекул або атомів, називається люмінесценцією.

Люмінесцентний аналіз, в основі якого лежить флюоресценція, набув широкого застосування. Вимірювання інтенсивності флюоресценції залежить від концентрації речовин, що дає змогу проводити кількісне визначення речовин на спеціальних приладах – флюориметрах. У ході цих досліджень як джерело збудження використовують ультрафіолетове випромінювання.

Електрофорез– розділення заряджених частинок в електричному полі. Різна молекулярна маса зарядів речовин визначає різну швидкість пересування, що дає змогу їх диференціювати. Швидкість руху йонів збільшується з посиленням електрофоретичного заряду, сили електричного поля, але зменшується зі збільшенням радіуса частинок, що рухаються, і збільшенням в’язкості середовища. На швидкість руху заряджених частинок впливає температура навколишнього середовища, з підвищенням якої наростає швидкість руху йонів.

Використовують такі методи електрофорезу: фронтальний, зональний, ізоелектричне фокусування, імуноелектрофорез.

Фронтальний електрофорез – розділення речовин у гомогенному розчині без стабілізації зон розподілу. Зональні методи електрофорезу дають змогу отримувати стабільні зони розподілу й класифікуються залежно від роздільного середовища. Для цього типу електрофорезу як середовище використовують порошки та інші пористі матеріали (крохмаль, целюлоза, полівінілхлорид), гелі (крохмальний, агаровий, поліакриламідний), смуги паперу та інших волокнистих матеріалів.

Зональний електрофорез залежно від джерела живлення і камери поділяється на горизонтальний і вертикальний (диск-електрофорез).

Імуноелектрофорез належить до найчутливіших і найсучасніших методів імунологічного аналізу. За допомогою цього методу можна визначити кількість компонентів суміші, а також ідентифікувати ці компоненти за їхньою електрофоретичною рухливістю, імунологічною специфічністю, а іноді – за хімічною природою, а також виявити речовини, здатні давати реакцію преципітації з антитілами, тобто переважно білки і вуглеводи.

Метод імуноелектрофорезу дає змогу дуже точно встановити компоненти складних білкових сумішей за їх імунологічною специфічністю та електрофоретичною рухливістю.

Хроматографія.

Для розділення й кількісного визначення білків і амінокислот, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ліпідів та інших метаболітів використовують різні методи хроматографії.

Існує декілька різновидів хроматографічного методу аналізу. Найважливіші з них:

· адсорбційна хроматографія, що базується на різній здатності окремих сполук адсорбуватися на тих чи тих сорбентах;

· йонообмінна, що базується на різній здатності розділюваних речовин до йонного обміну з тим чи тим іонітом;

· розподільна, що грунтується на різній розчинності розділюваних речовин, у двох рідинах, що частково змішуються;

· дифузна, що грунтується на розділенні речовин за швидкістю дифузії всередину сорбента (гель-фільтраційна хроматографія, при якій розділення речовин грунтується на механічному явищі молекулярного просіювання);

· хроматографія за спорідненістю (афінна хроматографія) – високоспецифічний метод розділення різних сполук, що базується на використанні нерозчинних форм біологічно активних речовин, споріднених з розділюваними речовинами.

У ході газової хроматографії розділення суміші речовин здійснюють в атмосфері газу.Адсорбційну, йонообмінну, розподільну, дифузну хроматографію можна проводити в колонках і на площині (на папері і в тонких шарах).

Гель-фільтрація дає змогу розділяти речовини залежно від їх молекулярної маси й форми молекул. Цей метод базується на здатності молекул різних розмірів і форм дифундувати в гелі з різною швидкістю. Для гель-фільтрації найчастіше застосовують декстранові гелі, які отримали назву сефадексів.

Полярографічний метод грунтується на принципі визначення сили струму під час окисно-відновних реакцій на зовнішній поверхні робочого електроду. На момент проходження струму в процесі електровідновлення або електроокиснення на полярограмах з’являються ділянки з силою струму пропорційною концентрації реагентів. Зміна висоти полярограм дає уявлення про концентрацію речовини.

Завдяки дослідженню біологічних об’єктів полярографічним методом виявляють катіони, аніони, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та інші речовини.

Особливе місце займає полярографічний метод у дослідженні білків і ферментів: дає відомості про деякі функціональні групи білків (-SH, -NH2, імідазольну групу), каталітичну активність ферментів тощо.

Використання манометричного і радіоізотопного методів дає змогу провести дослідження як на рівні клітини, так і на рівні цілого організму.

Імуноферментний аналіз (ІФА)– метод кількісного визначення речовин з дуже низькою концентрацією, що спричинюють утворення антитіл. Основою цього методу є реакція “ антиген – антитіло”, тобто, специфічне зв’язування антитіла з певною речовиною.

Для кількісного аналізу застосовують переважно два види ІФА. Першим етапом здійснення аналізу виступає зв’язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. Далі реалізується реакція конкурентного або непрямого типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. В іншому варіанті біологічні рідини реагують з іммобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решту суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються вже іммобілізованим антигеном.

Зразки сироватки крові, що містять досліджувану речовину поміщають у лунки планшету для мікротитрування із сорбованими на стінках антитілами, здатними специфічно зв’язувати цю речовину, наприклад гормон. Одночасно до інкубаційної суміші додають невелику кількість гормону, хімічно зв’язаного з ферментом, так званий кон’югат. Кон’югат і гормон, який визначають, конкурують між собою за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після реалізації зв’язування антигенів незв’язані молекули відмивають.

Для встановлення кількості зв’язаного кон’югованого антигену в лунки вносять субстратний буфер і пофарбовані продукти ферментативної реакції виявляють фотометрично. Чим більше гормону в тестованій пробі, тим менше кон’югату буде зв’язуватися з антитілами. Кількісна оцінка здійснюється з урахуванням калібрувальної кривої, побудованої за стандартними зразками з відомою концентрацією.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – це високоспецифічний метод експрес–діагностики, що дозволяє множити певні нуклеотидні послідовності до утворення необмеженого числа копій генів в таких кількостях, які можна виявити методом молекулярної гібридизації за допомогою електрофорезу. ПЛР базується на багатократному повторюванні циклів синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК–мішені з дезоксинуклеозидтрифосфатів у присутності термостабільної ДНК–полімерази, відповідного сольового буфера та олігонуклеотидних затравок–праймерів, що визначають кордони ампліфікованої ділянки ДНК-мішені. Для діагностики інфекційного захворювання підбираються системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дозволяють ампліфікувати фрагмент, що має для кожної системи праймерів свою довжину.

 









Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:


©2015- 2018 zdamsam.ru Размещенные материалы защищены законодательством РФ.