Дослід 1. Використання неорганічного фосфору дріжджовими клітинами в процесі їх бродіння.

У процесі спиртового бродіння, так як і при гліколізі, проходить фосфоролітичний розпад вуглеводів, що призводить до утворення як проміжних сполук, фосфорних ефірів тріоз і гексоз, а також і до утворення АТФ. При фосфорилуванні цих сполук зв’язується неорганічний фосфат, концентрація якого в розчині зменшується. За інтенсивністю зменшення кількості неорганічного фосфору можна судити про інтенсивність процесів фосфорилування.

Принцип методу. Фосфати в розчині сульфатної кислоти утворюють з молібдатами фосфорно-молібденові комплекси, які редукуються аскорбіновою кислотою до молібденової синьки. Кількість фосфатів визначають колориметрично на ФЕKу.

Матеріальне забезпечення: сухі дріжджі, порошок глюкози, або сахарози, стандартний розчин фосфату (10 мг фосфору/мл), фосфатний буфер (6 г Na₂HPO₄ · 2H₂O та 2 г KH₂PO₄ на 1 л H₂O – рН 7,2), 0,1 н розчин СН₃СООН, молібденовий реактив (суміш (NH₄)₂МоО₄ i Fe(HSO₄)₂), 0,5 % розчин аскорбінової кислоти, дистильована вода, штатив з пробірками, лійки, фільтри, ступка з товкачиком, водяна баня (37^оС), термометр, ФЕК.

Хід роботи. 1. Приготування бродильної суміші. В ступці розтирають 1 г сухих дріжджів з 5-а мл дистильованої води, отримуючи дріжджову суспензію. В чисту пробірку вносять 2 г глюкози, або сахарози, додають 5 мл фосфатного буферу (рН 7,2) і ставлять у водяну баню при температурі 37-38⁰С. Після розчинення глюкози або сахарози в фосфатному буфері до розчину додають 4 мл дріжджової суспензії та добре перемішують.

2. Дослідження в часі швидкості зв’язування неорганічного фосфору у пробах, взятих з бродильної суміші. Піпеткою набирають 1 мл бродильної суміші і вносять у чисту пробірку. Бродильну суміш, яка залишилась, ставлять у водяну баню при 37-38^оС на 90 хв, відбираючи в чисті пробірки по 1 мл бродильної суміші кожні 30 хв.

а) Осадження дріжджових клітин. До 1 мл бродильної суміші додають 3 мл 0,1 н розчину СН₃СООН. У слабкокислому середовищі (рН близьке до ізоелектричної точки) дріжджові клітини випадають в осад. Останні видаляють фільтруванням через сухий фільтр.

б) Розведення фосфатів. До 1 мл фільтрату додають 19 мл дистильованої води (1:20). З розведеного в 20 разів фільтрату відбирають піпеткою 1 мл і вносять у чисту пробірку, та додають 4 мл дистильваної води, отримуючи кінцеве розведення в 100 разів. Процедури (а) і (б), які описані вище, повторюють ще 3 рази, відбираючи кожні 30 хв по 1 мл бродильної суміші з пробірки, яка інкубується в водяній бані при 37-38^оС.

в) Колориметрування розчинів. Після відбору і обробки всіх чотирьох проб у кожну пробірку додають по 4,5 мл молібденового реактиву та по 0,5 мл 0,5 % розчину аскорбінової кислоти. Розчини в пробірках перемішують і не раніше, ніж через 2 хв, але не пізніше ніж через 5 хв, вимірюють оптичну густину на ФЕКу, при l = 750 нм. Отримані величини 4 проб записують.

У 4 пробірки вносять розчини в мл, як вказано нижче в таблиці. В 5-й лінійці приведені концентрації фосфору в мг% та ммоль/л, а в 6-й записують отримані на ФЕКу величини оптичних густин.

За результатами вимірів оптичних густин будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі ординат отримані оптичні гуcтини, а на осі абсцис концентрацію фосфору в ммоль/л.

Калібрувальний графік залежності концентрації неорганічного фосфату від часу інкубації

Користуючись калібрувальним графіком, за величинами оптичних густин досліджуваних проб знаходять у них концентрацію фосфору.

З отриманих даних будують графік залежності концентрації неорганічного фосфору від часу інкубації (концентрацію неорганічного фосфору в ммоль/л відкладають на осі ординат, час інкубації в хвилинах – на осі абсцис).