Способы получения мутантных штаммов микроорганизмов

3.4.1. Селекционные методы получения мутантов

Генетическая модификация микроорганизмов

Клетки организмов могутприобретать новые свойства в результате изменения их генома путем встраивания или исключения отдельных генов или их групп. Для этого используют метод получения рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, ДНК, которые затем вводятся в организм реципиента, становятся составной частью его генетического аппарата. Этот процесс состоит из нескольких этапов:

1. Выделение фрагмента гена, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий генетический элемент из цепочки ДНК с использованием ферментов-рестриктаз.

2. Встраивание ранее выдлеленного участка ДНК в вектор путем лигирования.

3. Введение рекомбинантная ДНК в живые клетки. Организмы, несущие в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, – трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным.

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова «фрагмент ДНК» и «объединение in vitro», что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д. Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет решать такие за дачи, как определение строения и функций белков, их индивидуальных доменов, а также расшифровывать механизмы регуляции экспрессии генов, получение многие белки, участвующие в регуляции обменных процессов, клеточной пролиферации и развитии организма. Используя технологию рекомбинантных ДНК, получают минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществляют детальный химический анализ генетического материала.

Получение рекомбинантной ДНК осуществляется с помощью следующих методов:

1. Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот – ДНК и РНК) – определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от англ. sequence - последовательность). В результате получается линейное символьное описание, которое cжато резюмирует атомную структуру молекулы. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК позволяет идентифицировать генетически важные участки ДНК. Секвенирование дает возможность довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 100 – 500 нуклеотидных пар, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

2. Рестрикция – разрезание ДНК на фрагменты ферментами-рестриктазами, которые режут ДНК на отрезки в определенных местах с целью выделения того или иного гена из цепочки ДНК. Всякая рестриктаза может опознать лишь одну стандартную последовательность из нескольких нуклеотидов. Молекулы рестриктазы химически связываются с ними и в этих местах рвут цепь ДНК. В настоящее время известно более 400 рестриктаз, способных расщеплять ДНК по 120 различным последовательностям нуклеотидов.

3. Лигирование – процесс «сшивания» генов с помощью особых ферментов, называемых лигазами. Лигазы сшивают участки ДНК, образовывая между их крайними нуклеотидами химическую связь.

4. Гибридизация нуклеиновых кислот. Метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (рН 13). При нагревании до 100 °С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг».

5. Трансформация – процесс введения рекомбинантной ДНК в живые клетки. Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном и реплицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации. Для этого используют векторы – мобильные генетические элементы: вирусы, плазмиды и транспозоны. Эти элементы могут присоединять те или иные гены к своей ДНК, а затем, оказавшись в клетке-хозяине, встраиваться вместе с чужеродным геном в хромосому хозяина, которая потом реплицируется уже вместе со всей этой новой последовательностью. В общих чертах это напоминает трансдукцию, имеющую место и в природе.

Методы генной инженерии

Секвенирование ДНК. В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины – вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель.

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный (метод Сангера).

Химический метод секвенирования ДНК. Исходный фрагмент ДНК, меченный ³²Р по 5'-концу, подвергается специфическому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные и нерадиоактивные фрагменты разной длины.

Рис. 3.1. Химический метод секвенирования ДНК

Например, если А будет находиться в положении 1, 4, 7, 20 во фрагменте из 221 основания, то будут получены радиоактивные фрагменты длиной 4, 7, 20 оснований, а также свободный аденин

Обычно химическая процедура расщепления ДНК выпол няется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использованием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А).

В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят радиоавтографию, и те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют "отпечатки" на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание – его положение. Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК. Аналогично наблюдают флюоресцентное окрашивание. Если для каждого из четырех нуклеотидов был подобран свой цвет флюоресцентной метки, то при электрофорезе их наносят на 1 дорожку. Тогда расположение нуклеотидов отмечено штрихами разного цвета, а процедуру считывания легко автоматизировать.

Энзиматический метод секвенирования(метод Сингера) основан на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь.

Перед собственно секвенированием проводят амплификацию ДНК участка, последовательность которого требуется определить. Амплификация (умножение) требуемого фрагмента молекулы ДНК происходит в результате многократного воспроизведения стандартного цикла полимеразной цепной реакции (ПЦР), который включает три последовательные стадии:

· разделение цепей ДНК;

· связывание праймеров с цепями ДНК;

· полимеразный синтез новых цепей ДНК с образованием копий нужного фрагмента ДНК.

Это позволяет увеличить количество ДНК в образце и, таким образом, определить последовательность большей длины(рис. 3.2).

Рестрикция (специфическое расщепление ДНК). Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами – рестрикцирующими нуклеазами бактерий, способными разрушить чужеродную ДНК (рис. 3.4).

Согласно номенклатуре, предложенной X. Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает родовое название, две последующие – первые буквы вида. Например, фермент из Е. coli обозначают как Есо или из Haemophilus influenzae – Hinи т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или HindII и т.д

Рис.3.4. Действие рестриктаз

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4 – 6 нуклеотидов. Большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными (или рестриктами с «тупыми» либо «липкими» концами. Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагментов коротких одноцепочечных участков. Такие участки способны образовывать комплементарные пары оснований

с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (липкие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое.

Полученный фрагмент ДНК (любого происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериофага.

Лигирование фрагментов ДНК. Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод). Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Комплементарные друг другу участки ДНК имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов (рис. 3.5).

Рис. 3.5. Схема рестриктазно - лигазного метода

Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию – сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод). Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент – концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 3.6). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

Рис. 3.6. Пришивание «липких» концов и сшивка фрагментов ДНК

Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью.

Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры – это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

Существуют большие наборы таких генных «переходников». При использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры «тупой конец – липкий конец».

При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента – эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить.

Гибридизация нуклеиновых кислот. Если водный раствор ДНК нагреть до 100 ^оС и повысить рН до 13, то ДНК диссоциирует на 2 цепи (денатурирует), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65^оС вело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК - ДНК, РНК - РНК, ДНК - РНК.

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого используют одноцепочечный фрагмент ДНК (или РНК), комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по ³²Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочечную молекулу ДНК, используемую в данном методе в качестве меченого индикатора, называют ДНК-зондом. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. ДНК-зонды применяются в различных целях.

Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов позволяет идентифицировать нуклеотидные последовательности в очень низкой концентрации и тем самым определять, какое количество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК-зонду, присутствует в геноме клетки.

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов; в реакциях гибридизации с РНК – для выявления экспрессии данного гена в различных клетках.

Синтез нуклеотидных последовательностей дает возможность перестраивать гены. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Он основан на важном свойстве ДНК – способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде.

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычис­лить, когда этот...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: