Вплив температури на швидкість ферментативної реакції

Швидкість ферментативної реакції, як і будь-яких інших, збільшується при підвищенні температури. Але тому що ферменти є білками, підвищення температури може прискорити їх денатурацію і привести до зниження швидкості реакції.

Денатурація тим значніша, чим вища температура і чим більший час інкубації. Щоб уникнути неточності, викликаною денатурацією, рекомендується вимірювати активність ферменту при 25°С, часто її вимірюють при 37°С.

Вплив температури на швидкість ферментативної реакції може бути виражений через температурний коефіцієнт Q₁₀ (2.3):

У межах 0-40°С Q₁₀ ферментативної реакції дорівнює 2. Іншими словами, при кожнім підвищенні температури на 10°С швидкість ферментативної реакції подвоюється. З підвищенням температури рух молекул прискорюється, і в молекул реагуючих речовин виявляється більше шансів зіштовхнутися одна з одною. Збільшується, отже, й імовірність того, що реакція між ними відбудеться. Температура, що забезпечує найбільшу активність, називається оптимальною температурою. За межами цього рівня швидкість ферментативної реакції знижується, незважаючи на збільшення частоти зіткнень. Відбувається це внаслідок руйнування вторинної і третинної структур ферменту, іншими словами, внаслідок того, що фермент перетерплює денатурацію.

Вплив температури на ферментативну активність ілюструють рисунки 6 та 7.

Коли температура наближається до крапки замерзання чи нижче неї, ферменти інактивуються, але денатурація при цьому не відбувається. З підвищенням температури їх каталітична активність знову відновлюється.

Для тривалого збереження харчових продуктів широко використовують такий спосіб, як швидке заморожування. Воно запобігає росту і розмноженню мікроорганізмів, а також інактивує їх травні ферменти, так що вони виявляються вже не в змозі викликати розкладання харчових продуктів. Інактивуються також ферменти, що знаходяться в самих харчових продуктах. Заморожені продукти не повинні розморожуватися до того моменту, як вони знадобляться.

Рис. 2.1. Вплив температури на активність ферменту

Рис.2.2. Хід ферментативної реакції при різних температурах

Тема: амілолітична активність. Вплив температури на швидкість ферментативної реакції.

Мета роботи: визначити амілолітичну активність культуральної рідини одного з представників культури Actinomyces sp. Дослідити залежність швидкості ферментативної реакції від температури.

Матеріали та устаткування: культуральна рідина (амілаза слини), піпетки місткістю 1 та 2 мл, пробірки, фільтри, лійки, термостат (37° С), кипляча водяна баня та баня із льодом, ФЕК, кювети товщиною 10 мм, скляні палички, олівці по склу, паперові фільтри.

Реактиви: 1,2%-ний розчин розчинного крохмалю; оцтово-ацетатний буфер рН 5,0; 0,5 М розчин NaCl; 1н розчин НСl; йодний реагент.

Розчин крохмалю готують перед вживанням. Для цього 1,2 г розчинного крохмалю суспендують у 10 мл дистильованої води (у колбі на 100 мл). Обережно додають, але не до мітки, киплячу дистильовану воду. Колбу поміщають у киплячу водяну баню на три хвилини і доливають після цього киплячою водою до мітки.

Розчин крохмалю охолоджують. Субстрат повинний бути прозорим.

Оцтово-ацетатний буфер рН 5,0 готують у такий спосіб: 73,4 мл 0,1 н. оцтової кислоти та 50 мл 0,1 н. NaOH зливають разом і доводять до 500 мл дистильованою водою.

Йодний реагент: 3 г KJ + 0,3 г I₂ розчиняють у дистильованій воді (до 100 мл).

Амілаза (діастаза) – фермент, що здійснює гідролітичне розщеплення полісахаридів (крохмалю, глікогену та інших продуктів, що містять три та більше залишків глюкози) до декстринів та мальтози.

Процес розпаду полісахаридів, що відбувається за місцем α-1,4-глюкозидних зв'язків, містить у собі ряд стадій: крохмаль > еритродекстрини > ахродекстрини > мальтотетроза > мальтоза > глюкоза. Кінцевий продукт дії амілази не дає кольорової реакції з йодом.

Більш багаті амілазою підшлункова і слинна залози. Амілаза крові має походження, головним чином, з підшлункової залози. Активними продуцентами амілолітичних ферментів є різні мікроорганізми: дріжджі, гриби, бактерії, актіноміцети.

Існуючі методи визначення активності α-амілази поділяються на дві основні групи:

1. Цукрофікуючі, засновані на визначенні цукрів, що утворюються з крохмалю, за редукуючою дією глюкози та мальтози.

2. Амілокластичні, засновані на визначенні залишку крохмалю, що не розщепився, за ступенем інтенсивності його реакції з йодом. Молекули декстринів, що мають 30 гексозних залишків, дають з йодом синє забарвлення; молекули, що складаються з 8-12 залишків – червоне; молекули ж, що складаються з 4-5 гексозних залишків, забарвлення не дають.

Принцип методу заснований на колориметричному визначенні концентрації крохмалю до і після його ферментативного гідролізу.

I. Культивування мікроорганізмів. Утворення амілолітичних ферментів культурою актіноміцету

Культуру Actinomyces sp. підтримують на скошеному середовищі Чапека: К₂НРО₄ - 0,5; КНО₃ - 3,0; MgSO₄ - 0,5; NaCl - 0,5; FeSO₄ - 0,01; СаСО₃ - 3,0; рибний гідролізат - 40 мл.

Усі компоненти стерилізуються при 1,5 атм. 30 хвилин; до стерильного середовища додають стерильну глюкозу в кількості 2%.

Після засіву пробірки поміщають на качалку при t = 27-28°С.

Для накопичення амілолітичних ферментів використовують середовище наступного складу (г/л): розчинний крохмаль - 10,0; К₂НРО₄- 0,3; MgSO₄ - 1,0; NaCl - 0,5; вода водопровідна - до 1л, рН 7,2-7,4.

Середовище стерилізують в автоклаві при 1 атм. 30 хвилин, розливають у цукрові пробірки по 10 мл і засівають 5% посівного матеріалу, вирощеного на середовищі Чапека протягом 3-х діб на качалці.

П. Визначення α -амілолітичної активності

1. Культуральну рідину відокремлюють від клітин фільтруванням через паперовий фільтр.

У дві пробірки - дослідну (А) та контрольну (В) вносять по 5,0 мл 1,2%-ного розчину крохмалю (що відповідає 60 мг), 3 мл оцтово-ацетатного буферу та 1,0 мл 0,5 М розчину NaCl. У третю пробірку - порівняльну (С) вносять 5,0 мл води, 3 мл оцтово-ацетатного буферу та 1 мл 0,5 М розчину NaCl. Після 10 хв прогрівання при +40°С в дослідну пробірку додають 1,0 мл розчину ферменту (культуральної рідини), вміст її гарно перемішують та термостатують точно 30 хв при +40°С. Інкубацію суміші переривають додаванням 2,0 мл 1 н. розчину соляної кислоти (при цьому рН стає нижче 2, що призводить до припинення дії амілази).

Контрольну (для виміру початкової екстинкції крохмалю) і порівняльну проби обробляють точно так само, як дослідну, але соляну кислоту додають до інкубації (тобто 1 мл досліджуваного матеріалу - культуральної рідини - вносять тільки після додавання в пробірку 2,0 мл 1 н. розчину соляної кислоти).

Потім 0,2 мл вмісту кожної пробірки (А, В, С) переносять у мірну колбу ємністю 50 мл, у яку попередньо поміщають 40 мл води, 0,5 мл соляної кислоти, 0,1 мл розчину йоду і, після розмішування, доводять об’єм дистильованою водою до мітки.

Дослідну та контрольну проби колориметрують на ФЕКі при червоному світлофільтрі (670 нм) у 10 мм кюветі проти вмісту порівняльної проби (С).

3. Таким чином проводять ферментативні реакції при кімнатній температурі (20°С), у бані із льодом (0°С) і в киплячій водяній бані (100°С).

Амілолітична активність розраховується за наступною формулою (3.1):

де Д_конт – оптична щільність проби з пробірки В;

Д_досл – оптична щільність проби з пробірки А.

За одиницю амілолітичної активності АЕ прийнята така кількість ферменту, що при t = 37°С протягом 30 хвилин розщеплює 10 мг крохмалю.

Результати записують у таблицю. Роблять висновки про характер впливу

ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: