Вплив рН на швидкість ферментативної реакції

Швидкість ферментативної реакції в значній мірі залежить від рН.

Кожен фермент має свій температурний та рН-оптимуми, при яких він виявляє максимальну активність. При постійній температурі будь-який фермент працює більш ефективно у вузьких межах рН (табл. 3.3). Оптимальним вважається те значення рН, при якому реакція протікає з максимальною швидкістю. При більш високих та більш низьких рН активність ферменту знижується. Це можна бачити на рисунку 8. Зрушення рН змінює заряд іонізованих кислотних і основних груп, від яких залежить специфічна форма молекул ферменту. В результаті змінюється форма молекул ферменту і, в першу чергу, форма його активного центру. При занадто різких зрушеннях рН фермент денатурує. Властивий даному ферменту оптимум рН не завжди збігається з рН його безпосереднього внутрішньоклітинного оточення. Це дозволяє припустити, що середовище, у якому знаходиться фермент, якоюсь мірою регулює його активність.

Таблиця 3.2. - Оптимуми рН для деяких ферментів

Активність Оптимум рН

Рис. 3.1. Залежність активності ферменту від рН

При вивченні впливу якого-небудь фактору на швидкість ферментативних реакцій всі інші фактори повинні залишатися незмінними і за можливістю мати оптимальне значення.

Для вивчення деяких властивостей ферментів можна використовувати гомогенати та екстракти тканин, а також культуральні рідини, що містять екзогенні ферменти.

Лабораторна робота № 4

Тема: визначення оптимального значення рН для дії сахарази (інвертази, - фруктофуранозідази).

Мета роботи: визначити активність ендогенної сахарази культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Дослідити залежність швидкості ферментативної реакції від рН.

Матеріали та устаткування: пекарські дріжджі (Saccharomyces cerevisiae), порцелянова ступка, лійки, термостат (37°С), скляні палички, олівці по склу, паперові фільтри, кварцовий пісок чи здрібнене скло, колби на 100- 200 мл, піпетки на 1, 5 та 10 мл, пробірки, таймер.

Реактиви: сахароза, 1%-ний розчин, Фелінгова рідина (чи реактив Бенедікта), 0,1 М розчини фосфатного буферу з різним значенням рН (3,0 - 9,0).

Реактив Фелінга: розчин А - 6,93 г сульфату міді (П) у 100 мл дистильованої води; розчин Б - 34,6 г сегнетової солі та 10,0 г гідроксиду натрію в 100 мл дистильованої води.

Розчин Бенедікта: до 50 мл дистильованої води додають 17,3 г цитрату натрію та 10 г карбонату натрію. Суміш нагрівають, не доводячи до кипіння, до повного розчинення солей. Розчиняють 1,73 г сульфату міді (П) у 10 мл води, отриманий розчин додають до першого розчину і загальний об’єм доводять до 100 мл дистильованою водою.

-фруктофуранозідаза (КФ 3.2. 1.26; сахараза, інвертаза) викликає гідролітичне розщеплення сахарози на глюкозу та фруктозу за рівнянням:

C₁₂H₂₂O₁₁ + Н₂О → 2 C₆H₁₂O₆.

Фермент каталізує також фруктотрансферазні реакції. -фрукто-фуранозідазу звичайно одержують із дріжджів та цвілевих грибів.

Оптимум рН для дії сахарази можна визначити при взаємодії її з сахарозою при різних значеннях рН середовища. Про активність сахарази можна судити за часом утворення глюкози, що реагує з реактивом Фелінга. При оптимальному значенні рН ферментативне розщеплення сахарози відбудеться з найбільшою швидкістю і відповідно проява ознак реакції (утворення осаду оксиду міді) виявиться при мінімальному часі інкубації.

В міру віддалення від крапки оптимального рН у кислу чи лужну зону час інкубації для розщеплення сахарози та утворення глюкози буде збільшуватися.

Кількість інвертованого цукру можна визначити методом Бертрана чи яким-небудь іншим методом.

Порядок виконання роботи

І. Виділення ферменту

2 г пресованих пекарських чи висушених на повітрі пивних дріжджів розтирають протягом 10 хв із кварцовим піском чи товченим склом та 5 мл дистильованої води, потім додають ще 20 мл води, нагрітої до 50°С, та через 10 хв фільтрують через складчастий фільтр. Фільтрат повинний бути прозорим, для чого перші порції мутного фільтрату знову виливають у лійку для фільтрування. Фільтрування можна замінити центрифугуванням - 10 хв при 3000 об/хв.

П. Визначення активності сахарази (β- фруктофуранозідази)

1. Перевіряють розчини сахарози, сахарази (екстракту дріжджів) і буферні розчини на присутність у них цукрів, що редукують, за допомогою реактиву Бенедікта.

Додають 2 мл прозорого синього реактиву Фелінга (чи Бенедікта) до 2 мл прозорого безбарвного 1%-ного розчину сахарази. Нагрівають суміш на водяній бані при 100°С 5 хвилин.

Таку ж саму процедуру проводять з 2 мл прозорого безбарвного 1%-ного розчину сахарози, а потім з 2 мл буферного розчину.

2. У 10 чистих сухих пробірок з етикетками 1-10 влити по 2 мл фелінгової рідини (реактиву Бенедікта).

3. Влити в одну пробірку 4 мл 1%-ного розчину сахарози, 4 мл буферного розчину з рН 3 і помістити на водяну баню, в якій протягом всього експерименту підтримується температура 38°С.

В іншу пробірку влити 4 мл сахарази і також помістити на водяну баню з температурою 38°С. Витримати обидві пробірки разом з їх вмістом на водяній бані протягом 5 хв для того, щоб вони придбали потрібну температуру.

4. Коли розчини на водяній бані приймуть її температуру, влити забуферений розчин сахарози в розчин ферменту і перевернути пробірку, щоб добре перемішати ці два розчини.

Відразу ж включити відлік часу і знову поставити пробірку, що містить реакційну суміш, на водяну баню. Протягом усього досліду беззупинно перемішувати реакційну суміш.

5. Після закінчення 1 хв інкубації перенести 1 мл суміші в пробірку 1. З інтервалами в 1 хв відібрати такі ж проби і перенести їх по черзі в пробірки 2-10.

Нагріти пробірки 1-10 на водяній бані з температурою 100°С протягом 5 хв. Відзначити тривалість інкубації, необхідної для появлення перших ознак реакції Бенедікта (випадіння цегляно-червоного осаду оксиду міді (I), що свідчить про позитивну реакцію на редукуючий цукор, отриманий при ферментативному розщепленні сахарози).

6. Повторити всю послідовність процедур з кожним з інших буферних розчинів (рН 4 - 9). Варто пам'ятати, що при відмірюванні різних буферних розчинів не можна користуватися однією піпеткою.

III. Оформлення роботи

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: