|
|
Выделение чистой культуры микробов(механические и биологические)Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. Для выделения чистой культуры аэробов используют методы, основанные на: ü Механическом разобщении бактериальных клеток o Метод Дригальского - распределение капли суспензии материала с ü помощью шпателя; o Рассев штрихом; o Метод Коха является количественным и позволяет определить ü количество бактерий в исследуемом материале ü Биологические методы: o Посев на элективные среды; o Метод Шукевича - посев материала в конденсат скошенного МПА для ü выделения чистых культур бактерий, обладающих ползучим ростом ü (например, протей); o Обработка кислотами и щелочами (например, микобактерии ü туберкулеза); o Прогревание при 80°С для выделения споровых форм; o Заражение лабораторных животных - для диагностики зоонозов и др. ü (туляремия). Выделение чистой культуры микробов является обязательным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по совокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма. Метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды. Очень широко применяются элективные питательные среды. При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроба, который предполагается выделить из исследуемого материала. Биологический метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза. Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43— 45 °С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю исследуемого материала. После этого прокаленной и остуженной; петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения материала. Метод дригальского Метод Дригальского основан на механическом разобщении на поверхности плотной, питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуемого материала. I этап. 1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовление мазка* окраска по Граму). v 2. Посев на чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового материала, засевают вторую и третью чашки. 3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37°С. II этап. 1. Макроскопическое изучение колоний по величине, форме, окраске, характеру поверхности, краев, консистенции.. 2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовление мазка, окраска по Граму). 3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным агаром. 4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37°С. III этап. Проверка культуры на чистоту (макроскопическим - однородный рост, микроскопическим — однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признаками клетки). IV этап. Идентификация проводится по: - ферментативным свойствам. - антигенным свойствам, токсигенности и другим признакам - фагочувствительности Выделение чистой культуры анаэробов I этап — обогащение на среде Китт-Тароцци, предварительно прокипяченной в течение 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются. II этап - получение изолированных колоний. На среде Китт-Тароцци обнаруживается помутнение с пузырьками газа. Ш этап - выделение чистой культуры проводится по одному из следующих методов: А) По Цейсслеру - каплю материала со среды Китт-Тароцци засевают в чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же шпателем производят посев во второй и третьей чашках; Б) По Вейнбергу - каплю материала со среды Китт-Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки Веньял-Вейона и инкубируют в термостате. IV и V этапы - идентификация в реакции нейтрализации на белых мышах. Заражение куриного эмбриона Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения: на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полость, в желточный мешок. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. 1этап Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, обжигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0,05 - 0,2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой. II этап Вскрытие эмбрионов проводят через 48-72 часа инкубации в термостате. Наличие вируса в хорион-аллантоисной оболочке определяют: 1. по белесоватым непрозрачным пятнам разной формы; 2. в реакции гемагглютинации. РГА Реакция гемагглютинации- это один из методов индикации вирусов. Ставится двумя методами: 1) капельным на стекле; 2) в пробирках - развернутая реакция. Компоненты: 1) исследуемый материал: аллантоисная жидкость, суспензия хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона, экстракт из культуры клеток, зараженных вирусом; 2) 5% взвесь куриных эритроцитов; 3) физиологический раствор. На чистое обезжиренное стекло наносят 1 каплю взвеси эритроцитов и 1 каплю исследуемого материала. При «+» результате - хлопья агглютинации эритроцитов. Реакция фаголизиса Реакция фаголизиса ставится для идентификации возбудителя дизентерии. Постановка реакции: 1) чистая культура шигелл на скошенном агаре; 2) 2 пробирки с МПБ - «опыт» и «контроль»; 3) дизентерийный бактериофаг На I этапе: 1) Проверка культуры шигелл на чистоту (окраска по Граму); 2) Посев в 2 пробирки с МПБ 3) В пробирку «опыт» добавить 2 капли (0,1 мл) дизентерийного бактериофага; 4) Посевы инкубировать в термостате 18-20 часов при темпратуре 37°С На II этапе: 1) Регистрация результатов посева В пробирке «контроль» имеется равномерное помутнение МПБ, т.к. культура шигелл оказалась жизнеспособной. В пробирке «опыт» МПБ прозрачный, т.е. дизентерийный бактериофаг вызвал лизис одноименной культуры бактерий. Определение фаготипа Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Цели фаготипиривания: 1. Помощь эпидемиологу в выявлении источников и путей циркуляции инфекции при внутрибольничном заражении; 2. Для идентификации микроба. Определение фаготипа стафилококка проводят при помощи фагов, разведенных до тест- разведения, обозначенного на этикетке. Каплю 4-х часовой бульонной культуры распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18 часов* при температуре 37°С. На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который в тест-разведении вызывает её полный лизис. В зависимости от чувствительности культуры к фагу наблюдается разная степень лизиса: + + + + - сплошной лизис + + + - сливной лизис с вторичным ростом + + - более 50 негативных колоний (стерильных пятен) + - единичные негативные колонии (стерильные пятна) - лизиса нет Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа). Метод бумажных дисков Биологическая активность антибиотиков выражается в международных единицах (ME). За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма, определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях. Степень чувствительности к антибиотикам необходимом определять для успешного проведения лечения. Наиболее распространен метод «бумажных дисков»: в чашку Петри с МПА «газоном» засевают взвесь изучаемой культуры микроба. На засеянную поверхность агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные антибиотиками. Диски располагают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии от края чашки 15 мм. Чашки выдерживают в термостате 18-20 часов при температуре 37 °С. Учёт результатов проводят на 2-ой день путем измерения зон задержки роста. Диаметр зоны задержки роста: Учет результатов ПЦР Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК. В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.
Способы учета результатов ПЦР: Качественная оценка (электрофоретический метод) Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет", как, например, при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Обычным способом разделения продуктов ПЦР и идентификации специфического гена является электрофорез в агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять собой целевую ДНК или участок гена, клонированный в плазмиде или амплифицированный с помощью ПЦР Для учета результатов качественной ПЦР может быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦР определяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальных флуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.
Методы учета результатов ПЦР без применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.
В таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный круг наиболее востребованных микроорганизмов. На российском рынке предлагается целый ряд flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, и ряда вирусных инфекций. Этот ассортимент патогенов вполне достаточен для многих больничных лабораторий, и они могут с начала своей деятельности сделать акцент на подобных методах анализа.
  Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...  ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...  Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычислить, когда этот...  Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор... Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:
|