Генотипическая изменчивость. Трансформационная изменчивость, значение для диагностики и профилактики инфекционных заболеваний.

Генотипическая изменчивость - изменчивость, которая появляется в связи с изменением генетического материала, называется наследственной или генотипической.

Одним из результатов наследственной изменчивости является образование новых вариантов организмов (новых генотипов), обеспечивающее разнообразие жизни, ее продолжение и эволюционное развитие.

Генотипическая изменчивость широко представлена в природе. Иногда это очень крупные изменения, проявляющиеся, например, в признаках махровости у цветков, коротконогости у животных (у овец, кур), но чаще это мелкие, едва заметные отклонения от нормы.

Изменение генотипа приводит, как правило, к изменению фенотипа.

В основе генотипической изменчивости обычно лежат новые комбинации аллелей, образующиеся в процессе мейоза, при оплодотворении или мутации. Поэтому наследственную (генотипическую) изменчивость подразделяют на два вида: комбинативную (лат. combinatio — объединение) и мутационную. В обоих случаях нарушаются структура гена и структура хромосом, т.е. изменяется последовательность нуклеотидов в ДНК, число хромосом, а также происходит расщепление аллельных пар генов; иными словами, меняется генотип. Все это и приводит к появлению новых наследуемых признаков.

Комбинативная изменчивость представляет собой результат перераспределения наследственного материала родителей среди их потомства. Перекомбинация, или рекомбинация, генов и хромосом обычно происходит при мейозе (в процессе кроссинговера, при расхождении гомологичных хромосом) и при оплодотворении. Комбинативная наследственная изменчивость является универсальным свойством всех организмов — от бактерий до высших растений и животных. Наблюдается она и у вирусов. Этот вид наследственной изменчивости имеет важное значение при эволюционных преобразованиях.

Мутационная изменчивость является результатом мутаций. Мутации — это внезапные изменения наследуемого генетического материала, приводящие к появлению новых признаков организма, способных передаваться последующему потомству. Мутации могут быть естественными и искусственно вызванными. В природе они могут возникать неожиданно (спонтанно), но чаще под влиянием мутагенов (мутация греч. henes — рождающий, рожденный), т.е. факторов, порождающих мутации.

Естественные мутации могут затрагивать разнообразные стороны строения и функций организма. Например, у дрозофилы описаны мутационные изменения формы крыльев, окраска тела, глаз, а также многих физиологических признаков (продолжительность жизни, плодовитость, устойчивость к повреждающим факторам и пр.).

Большинство мутаций нейтральны, однако бывают мутации, вредные для организма, некоторые (летальные) даже вызывают его гибель. Очень редко возникают полезные для организма мутации, которые улучшают какие-то свойства особи, но именно они, закрепленные в потомстве, дают ей некоторые преимущества в естественном отборе перед другими.

Генотипическая изменчивость присуща всем живым организмам. Она является основным источником генетического разнообразия особей внутри вида, чем обусловливает эволюцию видов в природе и отбор лучших форм в селекции.

Трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК.(трансформационная изменчивост ь). Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию,конъюгацию и т. д.

В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста.

В состоянии компетентности бактерии вырабатывают особый низкомолекулярный белок (фактор компетентности), активизирующий синтез аутолизина, эндонуклеазы I и ДНК-связывающего белка. Аутолизин частично разрушает клеточную стенку, что позволяет ДНК пройти через неё, а также снижает устойчивость бактерий к осмотическому шоку. В состоянии компетентности также снижается общая интенсивность метаболизма. Возможно искусственное приведение клеток в состояние компетентности. Для этого применяют среды с высоким содержанием ионов кальция, цезия, рубидия, электропорацию или заменяют клетки реципиента протопластами без клеточных стенок.

Эффективность трансформации определяется количеством колоний, выросших на чашке Петри после добавления к клеткам 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК и рассева клеток на питательную среду. Современные методы позволяют добиваться эффективности 10⁶—10⁹.

Поглощаемая ДНК должна быть двухнитевой (эффективность трансформации однонитевой ДНК на порядки ниже, однако несколько возрастает в кислой среде), её длина — не менее 450 пар оснований. Оптимальный pH для прохождения процесса — около 7. Для некоторых бактерий (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) поглощаемая ДНК должна содержать определённые последовательности.

ДНК необратимо адсорбируются на ДНК-связывающем белке, после чего одна из нитей разрезается эндонуклеазой на фрагменты длиной 2—4 тыс. пар оснований и проникает в клетку, вторая полностью разрушается. В случае, если эти фрагменты имеют высокую степень гомологии с какими-либо участками бактериальной хромосомы, возможна замена этих участков на них. Поэтому эффективность трансформации зависит от эволюционного расстояния между донором и реципиентом. Общее время процесса не превышает нескольких минут. Впоследствии, при делении, в одну дочернюю клетку попадает ДНК, построенная на основе исходной нити ДНК, в другую — на основе нити с включённым чужеродным фрагментом (выщепление).

От двух человек выделена культура стафилококка. Один из них болел пиодермией, второй – здоров. От чего это зависит, от каких качеств микроба? Как доказать, что выделенный штамм стафилококка причастен к развитию болезни? Как определить возможный источник?

Амёбиа́з — антропонозная инвазия с фекально-оральным механизмом передачи, которая характеризуется хроническим рецидивирующим колитомс внекишечными проявлениями. Наиболее часто термин "амёбиаз" применяют к амёбной дизентерии, вызываемой простейшим паразитом Entamoeba histolytica. К прочим амёбиазам относят амёбный энцефалит, вызываемый амёбами Naegleria fowleri, Acanthamoeba spp и B. mandrillaris, а также амёбный кератит, возбудителем которого являются представители рода Acanthamoeba.

Таксономия: тип Sarcomastigophorae, подтип Sarcodina, класс Lobosia, отряд Amoebida.

Морфология: Различают две стадии развития возбудителя: вегетативную и цистную. Вегетативная стадия имеет несколько форм: большая вегетативная (тканевая), малая вегетативная; предцистная форма, сходная с просветной, образующая цисты.

Циста (покоящаяся стадия) имеет овальную форму. Зрелая циста содержит 4 ядра. Просветная форма малоподвижна, обитает в просвете верхнего отдела толстой кишки как безвредный комменсал, питаясь бактериями и детритом.

Большая вегетативная форма образуется, при определенных условиях, из малой вегетативной формы. Она наиболее крупная, образует псевдоподии и обладает движением. Может фаго-цитировать эритроциты. Обнаруживается в свежих испражнениях при амебиазе.

Культивирование: на питательных средах, богатых питательными веществами.

Резистентность: Вне организма быстро (за 30 мин) погибают вегетативные формы возбудителя. Цисты устойчивы в окружающей среде, сохраняются в фекалиях и воде. В продуктах питания, на овощах и фруктах цисты сохраняются в течение нескольких дней. При кипячении погибают.

Эпидемиология: Амебиаз — антропонозная болезнь; источник инвазии - человек. Механизм передачи — фекально-оральный. Заражение происходит при занесении цист с продуктами питания, водой, через предметы домашнего обихода.

Патогенез и клиника: Цисты, попавшие в кишечник, и образовавшиеся затем из них просветные формы амеб могут обитать в толстой кишке, не вызывая заболевания. При снижении резистентности организма амебы внедряются в стенку кишки и размножаются. Развивается кишечный амебиаз.

Трофозоиты тканевой формы подвижны за счет формирования псевдоподий. Они проникают в стенку толстой кишки, вызывая некроз; способны фагоцитировать эритроциты; могут обнаруживаться в фекалиях человека. При некрозе образуются язвы. Клинически кишечный амебиаз проявляется в виде частого жидкого стула с кровью, сопровождающегося лихорадкой и дегидратацией. В испражнениях обнаруживают гной и слизь, иногда с кровью.

Амебы с током крови могут попадать в печень, легкие, головной мозг, в результате чего развивается внекишечный амебиаз.

Иммунитет: Нестойкий, активируется преимущественно клеточное звено.

Микробиологическая диагностика. Основным методом является микроскопическое исследование испражнений больного, а также содержимого абсцессов внутренних органов. Мазки окрашивают раствором Люголя или гематоксилином. Серологические исследования (РНГА, ИФА, РСК): наиболее высокий титр антител в сыворотке крови выявляют при внекишечном амебиазе.

Лечение: Применяют метронидазол, фурамид.

Профилактика: выявление и лечение цистовыделителей и носителей амеб, проведение общесанитарных мероприятий.

2. Генотипическая изменчивость. Трансдукция и лизогенная конверсия, значение для науки и практики.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В ее основе лежат мутации и рекомбинации.

Мутации бактерий принципиально не отличаются от мутаций эукариотических клеток. Особенностями мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления, так как имеется возможность работать с большими по численности популяциями бактерий.

Рекомбинации у бактерий отличаются от рекомбинаций у эукариот:

Во-первых, у бактерий имеется несколько механизмов рекомбинаций (обмена генетическим материалом).

Во-вторых, при рекомбинациях у бактерий образуется не зигота, как у эукариот, а мерозигота (несет полностью генетическую информацию реципиента и часть генетической информации донора в виде дополнения).

В третьих, при рекомбинациях у бактериальной клетки-рекомбината изменяется не только качество, но и количество генетической информации.

Трансформация - это обмен генетической информацией у бактерий путем введения в бактериальную клетку-реципиент готового препарата ДНК (специально приготовленного или непосредственно выделенного из клетки-донора). Чаще всего передача генетической информации происходит при культивировании реципиента на питательной среде, содержащей ДНК донора.

Для восприятия донорской ДНК при трансформации клетка-реципиент должна находится в определенном физиологическом состоянии (компетентности), которое достигается специальными методами обработки бактериальной популяции. При трансформации передаются единичные (чаще один) признаки. Трансформация является самым объективным свидетельством связи ДНК или ее фрагментов с тем или иным фенотипическим признаком, поскольку в реципиентную клетку вводится чистый препарат ДНК.

Трансдукция - это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту с помощью умеренных (трансдуцирующих) бактериофагов.

Трансдуцирующие фаги могут переносить один или более генов (признаков). Трансдукция бывает:

Это связано с локализацией трансдуцирующих фагов в геноме донора. В первом случае они располагаются всегда в одном месте хромосомы, во втором - их локализация непостоянна.

Конъюгация - это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту при их прямом контакте.

После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту. Основываясь на прерывании конъюгации через определенные промежутки времени, можно определить порядок расположения генов на хромосоме бактерий - построить хромосомные карты бактерий (картирование бактерий). Донорской функцией обладают F+ клетки.

Лизогенная конверсия, фаговая конверсия - изменение свойств бактериальной клетки вследствие заражения её умеренным бактериофагом. Например, ряд штаммов дифтерийной палочки приобретает способность образовывать дифтерийный токсин сразу же после проникновения фага в клетку и до момента её растворения — лизиса. Если в результате инфекции происходит лизогенизация, т. е. включение умеренного фага в геном бактерии в форме профага, то вновь приобретённые свойства становятся наследственными. Потеря профага приводит к потере бактерией тех свойств, которые возникли при лизогенной конверсии. Таким образом, лизогенная конверсия связана с добавлением к бактериальному геному новой генетической информации, которая вносится в клетку бактерии геномом фага. Изменение свойств бактерии в результате заражения умеренным фагом может происходить также путём трансдукции. Однако в отличие от трансдукции, при лизогенной конверсии изменение свойств бактерии сохраняется только до тех пор, пока в клетке присутствует фаг или профаг. Лизогенная конверсия. может быть причиной подавления или усиления ферментативной активности, изменения патогенных свойств, морфологии колоний, устойчивости к антибиотикам и др.

3. У двух реконвалесцентов проведены бактериологические исследования. У одного возбудитель не обнаружен, у другого – выявлен. Как оценить исход заболевания? С чем это может быть связано?

1. Лейшмании, кожный и висцеральный лейшманиоз.

Лейшманиозы (от имени У. Лейшмана, лат. Leishmaniasis) — группа паразитарных природно-очаговых, в основном зоонозных, трансмиссивных заболеваний, распространенных в тропических и субтропических странах; вызывается паразитирующими простейшими рода Leishmania, которыепередаются человеку через укусы москитов. Существует две основные формы этого заболевания: висцеральный лейшманиоз, или кала-азар, при котором поражаются органы ретикуло-эндотелиальной системы, и кожный лейшманиоз, при котором поражаются кожа и подкожные ткани.

Таксономия: тип Sarcomastigophorae, подтип Mastigophora — жгутиковые, класс Zoomastigophora, отряд Kinetoplastida, род Leishmania.

Характеристика возбудителей: внутриклеточные паразиты, развивающиеся в макрофагах или клетках ретикулоэндотелиальной системы. Размножаются простым делением, проходят два цикла бесполого развития: жгутиковый и безжгутиковый. В жгутиковом цикле паразиты развиваются на питательных средах или в кишечнике москита, зараженного при сосании крови больных людей или животных. Заглоченные москитом амастиготы превращаются в кишечнике в промастиготы, делятся и на 6е-сутки накапливтся в глотке москита. Возбудитель имеет удлиненную веретенообразную форму. Протоплазма содержит ядро, цитоплазму, зерна волютина и кинетопласт. Жгутик, отхо-дящий от заостренного конца, способствует перемещению лейшманий.

Безжгутиковый цикл проходит в ретикулоэндотелиальных клетках печени, селезенки, лимфатических узлов, в макрофагах инфицированного организма. Паразиты имеют округлую форму, без жгутиков; при окраске по Романовскому—Гимзе цитоплазма приобретает серовато-голубой цвет, а ядро и кинетопласт — красновато-фиолетовый.

Культивирование: питательная среда NNN, содержащую агар с дефибринированной кровью кролика. Лейшмании также растут на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона и в культурах клеток.

Эпидемиология: в странах теплого климата. Механизм передачи возбудителей — трансмиссивный, через укус переносчиков — москитов. Основные источники возбудителей: при кожном антропонозном лейшманиозе — люди; при кожном зоонозном лейшманиозе — грызуны; при висцеральных лейшманиозах — люди; при кожно-слизистом лейшманиозе — грызуны, дикие и домашние животные.

Патогенез и клиника. Различают два возбудителя кожного лейшманиоза: L. tropica — возбудитель антропонозного лейшманиоза и L. major — возбудитель зоонозного кожного лейшманиоза.

Антропонозный кожный лейшманиоз характеризуется длительным инкубационным периодом — несколько месяцев. На месте укуса москитом появляется бугорок, который увеличивается и через 3 месяца изъязвляется. Язвы чаще располагаются на лице и верхних конечностях, рубцуются к концу года. Зоонозный кожный лейшманиоз (рано изъзвляющийся лейшманиоз, пендинская язва, сельская форма) протекает более остро. Инкубационный период составляет 2—4 недели. Мокнущие язвы чаще локализуются на нижних конечностях. Кожно-слизистый лейшманиоз вызывают лейшмании комплекса L. braziliensis; развивается гранулематозное и язвенное поражение кожи носа, слизистых оболочек рта и гортани. Антрапонозный висцеральный лейшманиоз вызывается лейшманиями комплекса L. donovani; у больных поражаются печень, селезенка, лимфоузлы, костный мозг и пищеварительный тракт.

Микробиологическая диагностика. В мазках (из бугорков, содержимого язв, пунктатов из органов), окрашенных по Романовскому— Гимзе, обнаруживают внутриклеточно расположенные мелкие, овальной формы лейшмании (амастиготы). Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев на среду NNN: инкубация 3 недели. Серологические методы недостаточно специ-фичны. Возможно применение РИФ, ИФА.

Кожно-аллергический тест на ГЗТ к лейшманину применяют при эпидемиологических исследованиях лейшманиоза.

Лечение: При висцеральном лейшманиозе применяют препараты сурьмы и диамидины (пентамидин). При кожном лейшманиозе — акрихин, амфотерицин.

Профилактика: уничтожают больных животных, проводят борьбу с грызунами и москитами.

2.Бактериоциногения, ее генетическая сущность, методы определения, Бактериоциногения (бактериоцины + греч. genea порождение, образование; син. бактериоциногенность) - способность некоторых штаммов бактерий продуцировать бактериоцинов; бактериоцин может служить фактором устойчивости нормальной микрофлоры к патогенным микробам; у патогенных бактерий Б. может оказываться дополнительным фактором их патогенности.

Бактериоцины - антибактериальные вещества белковой природы, вырабатываемые бактериями и подавляющие жизнедеятельность других штаммов того же вида или родственных видов (активный антагонизм). Способность бактерий продуцировать бактериоцины определяется наличием в клетке бактериоциногенных факторов, определенных генетических детерминант. Способность продуцировать бактериоцин и устойчивость к гомологичному бактериоцину (иммунитет) - это основные признаки, отличающие бактериоциногенные микроорганизмы от небактериоциногенных.

В естественных условиях бактериоциногения может быть одним из факторов, влияющих на формирование микробного ценоза. Поэтому большой интерес представляет выяснение значения этого явления для развития популяции. У бактериоциногенных популяций суммарная защитная активность проявляется в подавлении развития других бактерий, обладающих сходными пищевыми потребностями (родственные виды микроорганизмов). Это подавление обеспечивается бактериоцином, который продуцируют отдельные клетки этой популяции. Эти клетки погибают, но остальные клетки популяции не чувствительны к бактериоцину, который вытесняет другие микроорганизмы, чувствительные к данному веществу. Таким образом, бактериоциногенные бактерии обладают важным селективным преимуществом в условиях микробных ассоциаций, естественно складывающихся в процессе эволюции.

Синтез бактериоцинов носит индуктивный или конститутивный характер и контролируется специальным типом автономных плазмид, обозначаемых Col-факторами. При слиянии с половым фактором или умеренным фагом они могут включаться в хромосому бактерий. Бактерии, содержащие Col-фактор, называются бактериоциногенными, а само явление носительства таких факторов - бактериоциногенией. Бактериоцины гетерогенны по спектру и способу действия, по хим. структуре и м.м., по антигенной специфичности. Механизм действия Б. состоит в ингибиции отдельных этапов синтеза макромолекул, к-рая наступает после адсорбции Б. на специальных рецепторах клеточной стенки чувствительных бактерий. Утрата рецепторов или репрессия их синтеза приводит к развитию устойчивости к действию соответствующих бактериоцинов. Обозначают бактериоцины по виду и роду бактерий, к-рые их синтезируют. напр., бактериоцины, синтезируемые кишечной палочкой, называют колицинами, стафилококками – стафилоцинами и т.д. Бактериоциногения- один из механизмов внутри- и межвидовой конкуренции бактерий. Так, бактериоциногенные штаммы нормальной микрофлоры участвуют в элиминации заносных патогенных и непатогенных микробов с кожи и слизистых оболочек животных, включая человека.

использования бактериоциногении в пищевых производствах для проведения нормальных ферментаций, а также для консервации пищи. Нужно отметить, что в пищевой и консервной промышленности применяются в основном микроорганизмы из семейства молочнокислых бактерий или образуемые ими бактериоцины.

В природном очаге отмечено несколько случаев заболевания людей с подозрением на бубонную форму чумы. У одного из заболевших проведены бактериоскопия содержимого бубона и посев на МПА для выделения чистой культуры. В мазке, окрашенном метиленовым синим, обнаружены мелкие овоидные, биполярно окрашенные палочки. После суточного инкубирования посева рост на питательной среде не отмечался. Для подтверждения диагноза была взята кровь больного и проведена биологическая проба, сделан мазок-отпечаток из органов животного. Результат микроскопии при окраске метиленовым синим: синего цвета овоидные, биполярно окрашенные мелкие палочки на фоне клеток ткани животного. Дать диагностическую оценку полученным результатам. Подтверждается ли диагноз чумы? Если да, то каким методом диагностики и почему? Может ли отсутствие роста культуры палочки чумы на питательной среде быть связано с явлением лизогении или существованием некультивируемых форм?

Диагноз чумы подтвержден - Биологическим методом.

Токсоплазмоз - это широко распространенное паразитарное заболевание человека и животных, которое вызывается простейшими микроорганизмами.

Таксономия: Возбудитель — Toxoplasma gondii, относится к типу Apicomplexa, классу Sporozoa, отряду Eucoccidiida.

Характеристика возбудителя. Toxoplasma gondii — облигатный внутриклеточный паразит. В жизненном цикле токсоплазм различают несколько морфологических форм: ооцисты, псевдоцисты, цисты, тахизоиты.

Ооцисты формируются в результате полового размножения паразита в клетках слизистой оболочки кишечника кошки— окончательных хозяев токсоплазм: разнополые гаметоциты сливаются с образованием ооцисты. Ооцисты выделяются с фекалиями кошки. Попав в кишечник человека, они освобождают спорозоиты, которые распространяются по лимфатическим сосудам, размножаются внутриклеточно бесполым путем. Размножившиеся паразиты (тахизоиты) внедряются затем в другие клетки. Они обнаруживаются при острой стадии инфекции.

Тахизоиты имеют характерную форму апельсиновой дольк, при окраске по Романовскому—Гимзе цитоплазма голубого цвета, а ядро — рубиново-красного.

Псевдоцисты не имеют оболочки; они образуются в пораженных клетках, макрофагах.

Цисты образуются внутри клеток хозяина. Они имеют плотную оболочку.

Культивирование: в куриных эмбрионах и на культурах тканей, а также путем заражения мышей и других животных.

Резистентность: Ооцисты могут в течение года сохранять жизнеспособность в окружающей среде. Токсоплазмы быстро погибают при выс. температуре.

Эпидемиология. Источники инвазии виды домашних и диких млекопитающих, птицы. Заражение человека происходит алиментарным путем в результате употребления в пищу термически слабо обработанных продуктов, содержащих в псевдоцистах и цистах трофозоиты паразита.

Патогенез и клиника. Токсоплазмы, проникшие в организм, достигают с током лимфы регионарных лимфоузлов, размножаются в них (тахизоиты), проникают в кровь, разносятся по организму, попадая в клетки ретикулоэндотелиальной системы всех внутренних органов, где образуют псевдоцисты и цисты. Токсоплазмы поражают нервные клетки, печень, почки, легкие, сердце, мышцы, глаза. Клиническая картина разнообразна: от умеренной лимфоаденопатии до лихорадки, сыпи, гепатоспленомегалии, фарингита, менингоэнцефалита, пневмонии и др.

Иммунитет: клеточный и гуморальный иммунитет. Развивается ГЗТ.

Микробиологическая диагностика: Проводится микроскопия мазка (из биоптатов крови, ликвора, пунктатов лимфоузлов), окрашенного по Романовскому—Гимзе. Реже применяется биологический метод: мыши погибают через 7—10 дней после парентерального введения им инфицированного материала (крови, ликвора) больных людей. Возможно культивирование токсоплазм на куриных эмбрионах.

Основным в диагностике токсоплазмоза является серологический метод: выявление IgM-антител свидетельствует о ранних сроках заболевания. IgG-антитела достигают максимума на 4—8й неделе болезни. Применяются РИФ, РИГА, РСК. Используют также аллергический метод — внутрикожную пробу с токсоплазмином, которая положительна с 4-й недели заболевания и далее в течение многих лет.

Лечение: комбинация пириметамина с сульфаниламидами.

Профилактика: неспецифическая - гигиенические требования (мытье рук перед едой; термическая обработка мяса.

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: