|
|
Определение уровня IgМ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии1. Готовят 1,25-1,5% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 (на 1 л воды берут 0,8 г веронала и 4,5 г мединала). Навеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на водяной бане при 56 °С до полного растворения полимера. 2. В раствор агара добавляют рассчитанное количество (расчет производят, исходя из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки, быстро и тщательно перемешивают. Каждый вариант антиизотипической антисыворотки добавляют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы). 3. Раствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стеклянные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик для ровного затвердевания агара/агарозы в гель. Гель прозрачен и бесцветен. На стандартное предметное стекло для микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуется примерно 3,2 мл смеси раствора агара с антисывороткой. 4. В геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) ряда лунок. Расстояния между центрами лунок - порядка 1,5 см. 5. Заранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентрациях. 6. В три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки - также по 5 мкл - заливают испытуемые сыворотки. 7. Стекла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 °С 24-48 ч. За это время происходит спонтанная диффузия белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимися в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимися в агаровом геле. Поскольку диффузия свободно идет во всех направлениях, преципитаты имеют форму правильных колец. Преципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измеряют в миллиметрах. 8. Для снижения фона образования неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой - 5% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор меняют несколько раз. 9. Если задачи работы требуют долгосрочного хранения препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и красят анилиновыми красителями, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красителя - 50 мл ледяной уксусной кислоты и 150 мл воды). Окрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).
Иммуноэлектрофорез В те же 40-е гг. XX в. биохимики научились проводить электрофоретическое разделение белков в гелевых средах. В 1953 г. П. Грабар и К. Уиллиамс (P. Grabar, C.S. Williams) предложили методику иммуноэлектрофореза, которая фактически представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белковых смесей и метода Оухтерлони и Элека. В геле с одного края пластины пробивают ряд из несколько лунок, в которые вносят исследуемые на содержание тех или иных интересующих белков растворы или сыворотки пациентов. К пластине с гелем прикладывают электрическое поле и проводят электрофорез. По завершении электрофореза в геле в центре пластины вырезают канавку, параллельную направлению движения белков в электрическом поле. В эту канавку вносят антисыворотку или смесь антител против искомых белков и оставляют на 16-24 ч для диффузии, после чего регистрируют образующиеся полосы преципитации. Число полос преципитации показывает, к какому количеству компонентов, находящихся в биопробе, в антисыворотке есть комплементарные антитела. Если при электрофорезе использовать калибраторы, т.е. известные белки в достаточных концентрациях, то сравнение полос преципитации материала из биопроб с полосами преципитации с калибровочными белками может стать доказательством наличия в испытуемом материале конкретного белка(ов). Существует множество модификаций метода иммуноэлектрофореза. На рис. 4.3 проиллюстрировн наиболее простой и употребляемый вариант.
В стартовые лунки для электрофореза внесены сыворотки крови двух пациентов - 1 и 2, в канавку в центре пластины по завершении электрофореза проб сывороток внесена смесь антисывороток против основных фракций сывороточных белков - альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов. После диффузии сыворотки-1 видны дуги преципитации со всеми основными фракциями сывороточных белков, в том числе с иммуноглобулинами. В сыворотке пациента 2 гамма-глобулины отсутствуют. На основании данных электрофореза пациенту 2 поставлен диагноз агаммаглобулинемии. «Ракетный» иммуноэлектрофорез Если к гелю на стеклах, полностью подготовленных для выполнения метода радиальной иммунодиффузии, приложить электрическое поле, то движение компонентов сывороток, в том числе иммуноглобулинов, из лунок в толщу геля будет происходить не в режиме спонтанной диффузии, а в принудительном режиме по силовым линиям электрического поля, что существенно ускоряет процесс. В результате преципитаты станут видны уже примерно через 1 ч, но будут иметь форму не колец, а вытянутых пиков, напоминающих летательные аппараты - ракеты. Такую модификацию метода иммунодиффузии называют «ракетным» иммуноэлектрофорезом. Внешний вид результатов «ракетного» иммуноэлектрофореза показан на рис. 4.4.
В настоящее время во многих лабораториях изотипы иммуноглобулинов определяют нефелометрическим методом. Специфическими реагентами служат моноклональные антиизотипические антитела. Количество иммунных комплексов оценивают на приборе нефелометре. Калибровку и расчет результатов осуществляют с помощью программного обеспечения.   Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычислить, когда этот...  ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...  Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...  Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем... Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:
|
Рис. 4.2. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая
Рис. 4.3. Схема иммуноэлектрофореза по Грабару и Уиллиамсу: а - схема установки; б - результаты электрофореза
Рис. 4.4. «Ракетный» иммуноэлектрофорез: 1 - пациент с агаммаглобулинемией; 2, 3, 4 - калибровочные растворы иммуноглобулинов; 5 - пациент с гипергаммаглобулинемией (возможна миеломная болезнь)