АДСОРБЦІЙНО-ХРОМАТОГРАФІЧНІ МЕТОДИ

Ці методи широко запроваджуються у виробництві ферментів, гормонів, рекомбінантних ДНК; для одержання БАР рослинного і тваринного походження, до чистоти яких ставлять особливо жорсткі вимоги, традиційна технологія очищення не під­ходить. У промисловому виробництві успішно себе зарекомен­дувала розподільна хромато-

графія, самий надійний і ефек­тивний метод очищення. Нині широко використовують безпе­рервну колонкову і ступінчасту хроматографію. Декілька відо­мих хроматографічних методів, побудованих на різних параме­трах розділюваних молекул, на­ведено у табл. 8.1.

8.4.1. ІОНООБМІННА ХРОМАТОГРАФІЯ

Хроматографія БАР за допомогою іонообмінних сор­бентів, названа іонообмінною,— це один із методів розділення, які мають найбільш тривалу історію розвитку. Тепер промислова іоно­обмінна хроматографія стала однією з найважливіших технологіч­них стадій одержання комерційно прийнятних кількостей БАР.

В основі іонообмінної хроматографії лежить реакція обміну між нерухомим твердим іонообмінним сорбентом і розчиненою у розчиннику речовиною.

8.4.2. ІОНООБМІННІ МАТЕРІАЛИ

Іонообмінні сорбенти — це нерозчинні у воді речо­вини, синтетичні або природні, які містять у своїй структурі іоно-генні групи кислого (катіоніти) або основного (аніоніти) характе­ру. Іони водню (при наявності катіонітів) або іони гідроксилу (при наявності аніонітів), що входять до складу іоногенних груп, мо­жуть обмінюватися з катіонами, які знаходяться в розчині, або аніонами за реакціями, утворюючи солеві форми іонітів:

де R — високомолекулярний аніон катіоніту або високомолеку-лярний катіон аніоніту. При взаємодії катіонітів у Н-формі з розчинами основ, а аніо­нітів в ОН-формі з розчинами кислот також відбувається соле-утворення у фазі іоніту поряд з нейтралізацією розчинів через утворення води за реакціями:

Таким чином, катіоніти в Н-формі представлені нерозчинни­ми кислотами, а аніоніти в ОН-формі — нерозчинними основами.

Природні іонообмінники — мінерали типу монтморилонітів, каолінітів та ін.

Синтетичні органічні іонообмінники — це здебільшого про­дукти кополімерізації або поліконденсації різних органічних ре­човин, в які введені іоногенні групи: —S0₃H, —COOH, —Р0₃Н та інші за наявним складом катіонітів (відповідно до цих груп каті­оніти називаються сульфокатіонітами, карбоксильними або фос­фатними); =NHJ, (CH₃)₃N⁺, =S⁺ та інші за наявним складом ані­онітів. Залежно від здатності іоногенних груп до дисоціації катіоніти поділяються на сильно- і слабокислі, а аніоніти — на сильно- і слабоосновні. Існують іоніти, які містять у своїй струк-

турі іоногенні групи різної природи, так звані поліфункціональні іоніти, наприклад катіоніт КУ-1, залежно від pH розчину обмін може відбуватися з різними групами. Полімерізаційні іоніти здебільшого являють собою круглі гранули різного діаметру. При одній і тій ж іоногенній групі і основному компонентові матриці вони відрізняються кількістю зшиваючого агента, наприклад, ка-тіоніти КУ-2-8 і КУ-2-20. Остання цифра характеризує кількість дивінілбензену, уведеного в реакційну суміш при кополімеріза-ції. Різниця в кількості зшиваючого агента суттєво позначається на такій властивості іонітів, як їх набухлість, а це, у свою чергу, позначається на вибірковості і кінетиці обміну.

Розвиток синтезу органічних іонітів привів до створення низ­ки специфічних їх різновидів: іонітів, які містять як кислі, так і основні іоногенні групи (так звані амфотерні іоніти); іонітів із підвищеною гідрофобністю поверхні гранул (олеофільні іоніти); іонітів, які мають пористу структуру за рахунок уведення при їх синтезі речовин-пароутворників (макропористі іоніти) і т. д. Сьо­годні випускають майже 600 найменувань різних синтетичних органічних іонітів.

Особливим родом іонообмінних матеріалів є іонообмінні мем­брани, які складаються із іонітів. Мембрани бувають гетерогенні, тобто коли дрібносумельгенний іоніт нанесений на полімерну інди­ферентну підкладку, і гомогенні, що являють собою іоніт у вигляді суцільного листа. Катіонообмінні мембрани мають властивість про­пускати через себе (знаходячись у розчині) при накладенні елект­ричного поля тільки катіони, аніонообмінні — тільки аніони.

8.4.3. ОСНОВНІ РОЗМІРИ, ЯКІ ХАРАКТЕРИЗУЮТЬ ІОНООБМІННИЙ ПРОЦЕС. ОБМІН ОРГАНІЧНИХ РЕЧОВИН

Основною практичною величиною,яка характеризує ефективність застосування іонітів для розділення суміші іонів, є концентраційна константа рівноваги відповідної іонообмінної реакції або коефіцієнт вибірковості і£_виб.

де в квадратних дужках наведена концентрація обмінюючих іо­нів в іоніті, а в круглих — концентрація відповідних іонів у роз­чині.

При і£_виб = 1 обмін не вибірковий. Якщо іС_виб < 1, це значить, що Ме⁺ має меншу спорідненість з іонітом, ніж іон Н⁺. Якщо К_вп6 > 1, то більша вибірковість поглинання іона з розчину.

Для здійснення іонообмінного поглинання іон з розчину повин­ний продифундувати до частинки іоніту, потім продифундувати усередині неї до іоногенної групи і, нарешті, має відбутися сама іонообмінна реакція.

Залежно від властивостей і структури матриці іоніту, концен­трації іонів у розчині, їх розмірів і будови, а також заповнення ними іоногенних груп іоніту, стадією, що визначає швидкість іо­нообмінного процесу, може бути або зовнішня, або внутрішня дифузія. Швидкість сорбції у разі зовнішньої дифузії при ліній­ній ізотермії сорбції визначається за рівнянням:

де а — концентрація іона в іоніті в момент часу t;

P — кінетичний коефіцієнт, P = 3Dj/(5 • r_Q);

D_x — коефіцієнт зовнішньої дифузії;

5 — товщина плівки рідини навколо зерна;

r₀ — радіус зерна іоніту;

С₀ — вихідна концентрація іона в розчині;

C — концентрація іона в розчині в момент часу t, рівноважна з а.

Швидкість сорбції при внутрішній дифузії виражається рів­нянням:

де р₂ — кінетичний коефіцієнт, р₂ = ЗБ₂/г|;

D₂ — коефіцієнт внутрішньої дифузії;

г₀ — радіус зерна;

а₀ — концентрація іонів у іоніті, рівноважна з С₀.

3 наведених формул випливає, що для визначення швидкості іонообмінного процесу дуже суттєвим є значення величин коефі­цієнтів дифузії, які характеризують іонообмінну систему. Для технології важливо встановити, який із процесів відповідальний за швидкість сумарного процесу, тому що можливості прискорен­ня поглинання при визначальній ролі зовнішньої або внутрішньої дифузії різні.

Іонообмінна хроматографія — один із найбільш застосову­ваних методів розділення і очищення білків, завдяки високій здат­ності сорбентів зв'язувати білок (50,0 г білка на 1 л іонообмінної смоли) та можливості використання різних методів елюювання (безперервного і ступінчастого).

Основний принцип іонного обміну можна проілюструвати рис. 8.1. На першому етапі водний розчин суміші білків пропус­кають через колонку з нерухомим шаром іонообмінної смоли.

Одним з найбільш популярним іонообмінником, що використо­вується для очищення білків, є карбоксиметилцелюлоза — катіо-нообмінна смола, одержана за допомогою введення карбоксимети-льних груп (несуть негативний заряд) у целюлозну матрицю. Білки в катіонній формі (несуть позитивний заряд) зв'язуються з цією смолою електростатичними силами. Потім адсорбований білок елю-юють буферними розчинами зі зростаючим значенням pH.

Поступова зміна властивостей елюента призводить до того, що слабозв'язані з носієм білки десорбуються першими, а потім — усі більш міцно зв'язані з іонообмінником. Отже, рухома фаза, яка до введення в колонку взагалі не містила білків, на виході з колонки буде збагачена десорбованими білками. Отриманий при промиванні колонки елюат збирають у вигляді фракцій невели­кого об'єму. Аналогічно здійснюють і хроматографію на іоно­обмінних смолах — діетиламіноцелюлозі.

ній промисловості найбільш широкого застосування набули сефа­декси G₂₅ і G₅₀ у вигляді гранул із діаметром пор 30—100 мкм і 20—80 мкм відповідно. Проникність мембрани для кожної з ре­човин суміші визначається розміром молекули. У зв'язку з цим гель-хроматографію іноді називають молекулярним просіюванням. Певний об'єм розчинника вимиває з колонки речовини з більшою молекулярною масою (сефадекси G₂₅) i з меншою молекулярною масою (сефадекси G₅₀).

Основною величиною, яка визначається в гель-хроматографії, є утримуваний об'єм V_e:

де V_Q і V — об'єми рухомої і нерухомої хроматографічних фаз; K_d — коефіцієнт розподілу, який залежить від співвідно­шення розмірів молекул і пор. Гель-фільтрація — метод, малочутливий до складу зразка, за­стосовується в основному при видаленні осадника, заміні буфера і знесоленні.

ГЕЛЬ-ФІЛЬТРАЦІЯ

Гель-фільтрація, або хроматографія на молекуляр­них ситах, дозволяє розділяти речовини з різними молекулярни­ми масами. У цьому випадку насадка колонки складається з час­тинок гелю з певним діаметром пор. Якщо розмір молекул більший від діаметра пор, то вони не можуть дифундувати в гель і швидко проходять через колонку, тоді як молекули меншого розміру про­никають у гель і тому рухаються повільніше (рис. 8.2).

Як сорбент зазвичай використовують сефадекси G₂₅, G₅₀, G₇₅, G₁₀₀, що складаються з полімерних ланцюгів полісахариду дек-страну, з'єднані через певні проміжки поперечними зв'язками і утворюють своєрідні молекулярні сита. У хіміко-фармацевтич-

ГІДРОФОБНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Метод гідрофобної хроматографії застосовують для розділення БАР на основі гідрофобних властивостей, характер­них для біологічних об'єктів.

В основі механізму селективності при гідрофобній хромато­графії лежить виявлення так званого гідрофобного ефекту, а та­кож модуляція електровалентних взаємодій, унаслідок зменшен­ня локальної діелектричної сталої середовища при введенні неполярних радикалів або зниженні активності розчинника.

Гідрофобна хроматографія реалізується у вигляді декількох різних процесів. Найчастіше сорбція амфільних сполук гідрофоб-

ними сорбентами здійснюється з розведених водних розчинів при низьких значеннях pH середовища (2,0—4,0), а елюація — зни­женням так званої елюатропної сили рухомої фази, що досягаєть­ся зміною pH, зменшенням полярності елюенту (при додаванні спиртів, детергентів та інших органічних модифікаторів). Цей вид хроматографії одержав назву зворотнофазної (ЗФХ).

При введенні в розчин амфільних сполук, здатних вступати у взаємодію з менш роздільними гідрофобними компонентами, останні все ж можна розділити.

Таким методом на неполярних сорбентах удається розділити навіть іонізовані сполуки, якщо додати в розчин протилежно за­ряджені амфільні сполуки, здатні утворювати іонні пари з дослі­джуваними компонентами. Цей вид хроматографії був названий іон-парною зворотнофазною хроматографією.

Гідрофобна взаємодія реалізується також і при так званій ви-солювальній хроматографії (BX), яку часто називають хромато­графією гідрофобних взаємодій, основний принцип якої полягає в сорбції амфільних сполук із водних розчинів при великій кон­центрації солей з подальшою елюацією сольовими розчинами з більш низькою іонною силою або водою. Іноді елюацію здійсню­ють таким способом, що одночасно зі зменшенням концентрації солі підвищують концентрацію гідрофобного витисника. Як у зво-ротнофазній, так і висолювальній хроматографії можуть викори­стовуватися ті самі типи сорбентів із пришитими неполярними радикалами.

8.6.1. СОРБЕНТИ ДЛЯ ГІДРОФОБНОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

При проведенні гідрофобної технології слід врахову­вати фізико-хімічні параметри сорбентів: пористість, питому по­верхню, гідрофільні і гідрофобні властивості, хімічну стабільність, інертність, проникність. Усім цим вимогам відповідають зворот-нофазні гідрофобні сорбенти і макропористі гетерогенні полімерні сорбенти типу солоза K 30/40, K 20/40, K 10/40, КГ 8/40, гідро­фобні властивості яких виражені більш слабко, ніж у зворотно-фазних сорбентів.

Поверхня кремнеземних сорбентів містить велику кількість силанольних (SiOH) і силоксанових груп (Si—0—Si), a також не­велику кількість домішок оксидів металів (табл. 8.2). Найбільшу хімічну однорідність мають аеросилогелі (силохроми), одержані спіканням частинок непористого високодисперсного силіцію ді-оксиду — аеросилу.

Різні модифікації методів ЗФХ широко застосовують для очи­щення пептидів, таких, як окситоцин, ліпресин, АКРГ і його по-

Таблиця 8.2 Деякі типи кремнеземних сорбентів для ЗФХ біологічно активних речовин

хідних, пептидного гормону росту — соматотропіну, пептидних антибіотиків, лейкоцитарного інтерферону, для розділення висо-комолекулярних білків (хімотрипсиногену, феритину та ін.).

Використання гідрофобної хроматографії зручне і при роботі з висококонцентрованими розчинами. Так, розчин амонію суль­фату в концентраціях, дещо нижчих за необхідні для висолюван­ня білка, сприяє зв'язуванню білків із гідрофобними гелями. Ви­сока концентрація солі знижує розчинність білків і збільшує їх здатність взаємодіяти з неполярною поверхнею сорбенту. Фракці­онування зв'язаних білків часто досягається зниженням полярно­сті елюенту (наприклад, за допомогою поліетиленгліколю).

Таблиця 8.3 При використанні

Іон-парні агенти іон-парних агентів дося-

гається додаткове поси­лення селективності зво-ротнофазних адсорбентів при розділенні білків, олігопептидів та інших БАР.

У табл. 8.3 наведений список катіонних і аніон­них амфільних сполук, що використовуються як іон-парні агенти. При доборі умов розділення суміші білків при ЗФХ обов'язко­во враховують pH розчину, в'язкість і температуру.

8.7. АФІННА ХРОМАТОГРАФІЯ

Цікавим хроматографічним методом є афінна хро­матографія, заснована на нативній специфічності деяких біопо-лімерів, особливо якщо вони містяться в культуральній рідині в невеликих концентраціях — менше 1 мкг/мл. У цьому методі хороше розділення досягається за рахунок специфічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною.

Між афінною хроматографією і іншими більш традиційними методами адсорбційної або іонообмінної хроматографії існують значні відмінності. У традиційних хроматографічних методах спо­чатку адсорбуються всі компоненти суміші, а їх розділення здій­снюється на стадії десорбції за допомогою, наприклад, заміни концентрації елюенту або концентрації солей у елюенті, або по­ступового підвищення pH елюенту. Навпаки, специфічність афін­ної хроматографії визначається в основному на стадії сорбції (рис. 8.3). Тому в афінній хроматографії через колонку доцільно

пропускати розчин суміші, яка розділяється протягом досить три­валого проміжку часу, поки не буде досягнуте насичення нерухо­мої фази, тому що в ній адсорбуються практично тільки сполуки, що виділяються. Таким чином, проведення розділення БАР в афін­ній хроматографії наближається до звичайної сорбції в нерухомо­му шарі аж до насичення шару адсорбенту і різко відрізняється від звичайного розділення багатокомпонентної суміші, яку вво­дять у колонку одноразово у вигляді концентрованого розчину.

У цьому методі хороше розділення досягається за рахунок спе­цифічної взаємодії між іммобілізованим агентом і розчиненою речовиною. Показано три стадії: уведення суміші речовин а, роз­ділення б; елюювання, зв'язане з нерухомою фазоюкомпонента суміші в.

8.7.1. СОРБЕНТИ ДЛЯ АФІННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

Сорбентами для афінної хроматографії, як правило, є полімери, що використовуються для гельпроникної хроматогра­фії після цілеспрямованої модифікації (агарози, поліакриламіди, целюлози, пористі стекла).

Найважливіший параметр при модифікації вихідних мат­риць — об'ємна концентрація, що відповідає угрупованню^ і яке, як правило, вибирається емпірично. Другий найважливіший пара­метр _ стабільність нанесеного афінату в процесі сорбції — елюа-ції. Якщо афінатами є білки, наприклад, поліклональні або моно-клональні антитіла, білкові і пептидні інгібітори, то стабільність шару афінату можна підвищити, проводячи додаткову міжмолеку­лярну зшивку. Концентрацію зшиваючого агента (наприклад, глу-тарового альдегіду) слід вибирати з урахуванням потреби уникну­ти істотної зміни конформації зшитих білків, що часто призводить до втрати афінату.

При виборі вихідного сорбенту доводиться приділяти увагу скороченню розмірів доступних зон у порах після введення в них протяжливих афінатів. Тому матриці для біоспецифічної хрома­тографії з об'ємними афінатами повинні мати діаметри пор, які перевищують у 3—5 разів суму хроматографічних діаметрів мак­ромолекул комплексів антиген—антитіло, білок—інгібітор і т. д.

При використанні білків як афінатів слід враховувати гетеро­генність сорбційних центрів, зумовлену такими чинниками, як гетерогенність білків до приєднання, вплив протеаз і денатурації, зміна структури і властивостей афінатів у процесі приєднання, а також у процесі розділення. Цей чинник виявляється особливо суттєвим з погляду впливу навантаження на колонку як при сорб­ції, так і при виборі умов десорбції.

Суть методу біоспецифічної хроматографії полягає в тому, що між одним або обмеженим числом білків-ферментів із множини

наявних у суміші, яка фракціонується, і полімерним сорбентом утворюється досить стабільний зв'язок, у результаті чого ці білки з розчину переходять на нерозчинний сорбент, що підвищує його селективність.

Висока селективність біоспецифічних сорбентів забезпечуєть­ся тим, що як ліганди використовуються речовини, які специфіч­но взаємодіють з активним центром ферменту, що виділяється. Центром зв'язування служать субстрати, що приєднуються до по­лімерних матриць, їх аналоги, оборотні інгібітори, коферменти, антитіла та інші речовини, так звані ліганди.

Таблиця 8.4 Приклади спорідненості біологічних молекул

За своєю природою афінна хроматографія є варіантом адсорб­ційної хроматографії і її основних закономірностей, близьких зво-ротнофазній та іншим видам адсорбційної хроматографії. Вико­ристовуючи рівняння

можна показати, що утримування БАР відбувається тільки за умови [Р₀] > K_D, коли концентрація іммобілізованого афінату [Р₀] більше константи дисоціації комплексу фермент—афінат, напри­клад, відносне утримування V_e = V_Q = 10 при [PJ = 1 ммоль/л можливо при розмірі константи дисоціації K_D * 10"⁴ моль/л. Оче­видно, що при використанні афінатів з більшою величиною K_D необхідно підвищувати концентрацію іммобілізованого афінату. Навпаки, при використанні афінатів із дуже малими величинами K_D можна одержати ефективно утримувальні сорбенти навіть при невеликих концентраціях афінатів.

Другим компонентом біоспецифічного сорбенту є полімерна матриця, до якої приєднується ліганд. Матрицею може бути будь-який полімер, що у тій або іншій мірі задовольняє такі вимоги:

— великопористість гелевої структури;

— гідрофільність, що забезпечує добру взаємодію її з водою і відсутність неспецифічного зв'язування білків з гідрофобними центрами;

— відсутність в структурі заряджених груп;

— здатність полімера легко активуватися певними хімічними агентами.

Зазначеним вимогам відповідають: синтетичні полімери — поліакриламіди, сферони, а також великопористе скло і силіка­гелі.

Звичайно хроматографічний процес складається з послідовно мінливих етапів сорбції, видалення несорбованих білків і елюації сорбованих ферментів.

Великі перспективи відкриває використання багатоклональ-них антитіл для приготування афінних гелів. Досить 4—5 анти­тіл, щоб приготувати 1 л афінного гелю. Такі гелі успішно вико­ристовують для виділення із середовища культивування тваринних клітин, наприклад, гормону росту людини — самототропіну та інтерферону.

Спрямований синтез біоспецифічних сорбентів і вибір режи­мів афінної хроматографії дозволяє домогтися таких високих сту­пенів очищення БАР, які недосяжні для інших хроматографіч­них прийомів. За одну стадію ступінь очищення може досягати 10²—10³ разів.

8.8. ЕЛЕКТРОФОРЕЗ

Електрофорезом називають розділення БАР завдя­ки різній швидкості її переміщення в електричному полі. Постій­на швидкість U досягається частинкою із зарядом q, у рідкому середовищі під впливом електричного поля з напруженістю E, визначається балансом

Оскільки взагалі кожний білок має свій власний, результую­чий заряд, то накладення електричного поля призводить до того, що різні білки рухаються з різними швидкостями. Таким чином суміш декількох білків можна розділити на індивідуальні компо-

ненти. За допомогою зміни рН можна регулювати електрофорети­чну рухомість білка. Якщо p/ окремого білка менше рН середови­ща, то його заряд і швидкість будуть негативними. Навпаки, біл­ки з pI > рН рухатимуться в позитивному напрямі. Цей принцип покладений в основу одного з методів визначення pJ білків та інших речовин; у градієнті рН p/ білка дорівнює рН, при якому його електрофоретична рухомість U_e дорівнює нулю.

У методі електрофорезу в потоці рідка фаза рухається перпен­дикулярно напряму електричного поля, що дозволяє здійснювати безперервне розділення. При електрофорезі в гелі на рух молекул БАР впливають процеси адсорбції і десорбції, а також опір дифузії.

КРИСТАЛІЗАЦІЯ

Процес утворення і росту кристалів із розчинів і газо­вої фази називають кристалізацією. Зазвичай речовини мають кри­сталічні ґратки строго визначеної конфігурації, за винятком полі­морфних речовин. Ряд речовин утворюють кристалогідрати, причому кількість включених молекул води залежить від температури. Для утворення кристалів із розчинів необхідне пересичення, зумовлене різницею вихідної концентрації а_п і рівноважної концентрації на­сичення (граничної розчинності А_п). Кристалізація відбувається, коли перехід речовини з рідкого у твердий стан супроводжується зменшенням вільної енергії системи Ф, тобто:

де p — густина зародка кристала;

V і F — його об'єм і поверхня; M — його молекулярна маса;

ф₂ і ф_х — хімічні потенціали вихідної і нової фаз; а — міжфазний поверхневий натяг.

Для одержання крупнокристалічного порошку кристалізацію ведуть при малому пересиченні, у розчин уводять кристали для затравки, дрібні кристали видаляютьу процесі кристалізації, кри­сталічний продукт повторно обробляють у насиченому розчині (при цьому дрібні кристали розчиняються), уводять у розчин сторонні домішки, підвищують температуру (обмежено).

Методи кристалізації: випарювання розчинника (ізотермічний), охолодження гарячих розчинів (ізогідричний), одночасне охоло­дження і випарювання (комбінований), додавання в розчин ін­ших речовин, які знімають розчинність (висолювання), виморо­жування.

Схеми кристалізації: одноразова (з повним поверненням маточ­ного розчину і періодично повним зливанням, із частковим його

поверненням, із частковим поверненням після додаткового упа­рювання і кристалізації); дворазова з такими ж маніпуляціями маточним розчином, причому на злив подають маточний розчин після першого кристалізатора, а після другого — насичений мато­чний розчин повертають у перший кристалізатор.

У фармацевтичній промисловості кристалізацією виділяють тверді речовини з їх розчинів, розділяють суміші речовин на фрак­ції та очищають їх від домішок. Для дуже глибокого очищення термолабільних речовин слід було б використовувати зонну плав­ку, для розділення евтектичних розплавів або речовин з низьки­ми коефіцієнтами розподілу — екстракційну кристалізацію. При розділенні евтектичних і азеотропних розплавів доцільно поєдна­ти процеси кристалізації і ректифікації.

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычис­лить, когда этот...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: