Методы стерилизации сред и лабораторной посуды

Стерилизация — обработка объектов, при которой достигается полное уничтожение всех микроорганизмов. В результате стерилизации объект становится свободным как от патогенных, так и от сапрофитных микробов. Существуют различные методы и способы стерилизации, в основе которых лежит действие физических или химических факторов. Критерием гибели микроорганизмов является необратимая утрата способности к размножению, что можно оценить путем количественного подсчета числа колоний после высева смывов на чашки с питательными средами.

Наиболее широко применяют методы тепловой стерилизации: кипячением, сухим жаром в атмосфере горячего воздуха или влажным жаром при помощи пара, а также прокаливанием предметов в огне.

Прокаливание на огне — надежный метод стерилизации бактериологических петель, металлических и стеклянных предметов. Однако применяется ограниченно ввиду их порчи.

Стерилизация сухим жаром или горячим воздухом производится в сушильных шкафах или печах Пастера при температуре 160—170°С в течение 1—1,5 ч по достижении заданной температуры. Этим методом стерилизуют лабораторную посуду, инструменты, минеральные масла, вазелин. Жидкости и резину сухим жаром стерилизовать нельзя. Предметы, подлежащие стерилизации, заворачивают в бумагу или закладывают в металлические пеналы для предохранения от последующего загрязнения. Необходимо помнить, что при темпера-, туре выше 170°С начинается обугливание бумаги, ваты, марли, а при более низкой температуре не происходит гибели спор.

Стерилизация кипячением в течение 30 мин убивает вегетативные формы микробов. Споры многих бактерий при этом сохраняются, выдерживая кипячение в течение нескольких часов. Кипячению в специальных стерилизаторах подвергают шприцы, хирургические инструменты, иглы, резиновые трубки. Для повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют 2% гидрокарбоната натрия.
Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) является наиболее надежным и быстрым методом стерилизации. Автоклав представляет собой двухстенный металлический котел, покрытый снаружи кожухом и имеющий герметически закрывающуюся крышку. В современных горизонтальных автоклавах под рабочим котлом находится бачок с водомерным стеклом и электронагревательными элементами, куда наливают воду до определенной метки на водомерном стекле. Вода нагревается и образующийся при этом пар по специальному патрубку, соединенному с котлом автоклава, поступает в рабочую камеру котла. Пар постепенно вытесняет из рабочей камеры воздух, который выходит наружу через специальный выпускной кран. После того как воздух будет полностью вытеснен из рабочей камеры паром и из выпускного клапана пойдет насыщенный «сухой пар», крышку герметически закрывают. Пар доводят до нужного для стерилизации давления, которое определяют по имеющемуся на автоклаве манометру, и проводят стерилизацию в течение 20 мин. По окончании стерилизации автоклав отключают, ждут, пока давление не снизится до нуля, выпускают постепенно пар и открывают автоклав. Стерилизация в автоклаве таких веществ, как вазелин, масло, песок, малоэффективна вследствие того, что в них пар проникает плохо или совсем не проникает. Некоторые питательные среды (например, содержащие сахара) нельзя стерилизовать паром под давлением, так как они карамелизуются, поэтому их подвергают дробной стерилизации текучим паром.

Стерилизация текучим паром проводится в аппарате Коха или в автоклаве при не завинченной крышке и открытом выпускном кране. На дно аппарата Коха наливают воду и нагревают до 100°С. Образующийся пар движется вверх через заложенный материал и стерилизует его. Так как однократное действие паров воды не убивает споры, применяют дробную стерилизацию — 3 дня подряд по 30 мин. Споры, не погибшие при первом прогревании, прорастают до следующего дня в вегетативные формы и погибают при втором и третьем прогревания.

Для веществ, разрушающихся при 100°С (например, жидкости содержащие белок), применяют другой вид дробной стерилизации — тиндализацию. Стерилизуемое вещество прогревают на водяной бане по 1 ч при 56— 60°С в течение 5—6 дней. Для освобождения от вегетативных форм микробов прибегают к пастеризации — однократному прогреванию при 70°С в течение 30 мин с последующим быстрым охлаждением и хранением на холоду, чтобы не проросли споры. Этот метод применяют для обеззараживания и сохранения молока.
Стерилизация фильтрованием (холодная стерилизация) через бактериальные фильтры применяется для освобождения жидкостей от бактерий. Этот метод используют в тех случаях, когда стерилизующая жидкость портится от нагревания, при необходимости отделения бактериальных клеток от растворимых продуктов их жизнедеятельности (экзотоксины, антибиотики и др.), фагов, вирусов. Бактериальные фильтры изготовляют из фарфора, каолина, мелко пористого стекла пирекс, асбеста, целлюлозы, нитроклетчатки и других мелкопористых материалов. В механизме стерилизации фильтрованием играют роль размер пор и адсорбция микробов на стенках пор фильтров. Фильтры имеют форму свечей (Шамберлана, Беркефельда) или пластинок из асбеста, нитроцеллюлозы (мембранные фильтры), которые вкладывают в специальные фильтровальные приборы (аппарат Зейтца, прибор Рублевской водопроводной станции). Перед работой их стерилизуют. Фильтрацию производят с разрежением воздуха внутри сосуда-приемника.

Химическая стерилизация применяется в том случае, если объекты нельзя автоклавировать. Обычно это питательные среды, содержащие термолабильные вещества. Химическое вещество должно быть не только токсичным, но и летучим для быстрого исчезновения из простерилизованного объекта. Наилучшим является окись этилена — жидкость кипящая при 10,7°С. Окись этилена в жидком виде добавляют в раствор при температуре от 0 до 4°С в конечной концентрации 0,5—1%. При температуре выше точки кипения окись этилена используют как стерилизующий газ, для стерилизации сложной медицинской аппаратуры. Окись этилена губительно действует на вегетативные и споровые формы бактерий. Ее используют в промышленности для стерилизации пластмассовых чашек Петри и других предметов, которые плавятся при температуре выше 100°С. Применение окиси этилена ограничено, так как вещество токсично, нестойко, взрывоопасно.

10. Понятие "чистая культура". Методы получения чистой культуры.

Чистые культуры - микроорганизмы одного и того же вида, выращенные в искусственной среде in vitro («в пробирке») и являющиеся потомками одной бактериальной клетки. Своего рода изолированное скопление микроорганизмов, выведенное с помощью посева на питательных средах.

Основным методом выделения чистых культур бактерий является метод, предложенный Р. Кохом, принцип которого заключается в получении культуры бактерий из изолированных колоний. При выделении чистой культуры аэробов накопительную культуру или исследуемый материал высевают на плотную питательную среду. Порядок работы следующий. Расплавленную питательную среду разливают в стерильные чашки Петри. После того как среда застынет, на её поверхность наносят каплю исследуемого материала и стерильным шпателем Дригальского распределяют каплю сначала по одной стороне поверхности питательной среды в чашке Петри, затем по второй. Этим же шпателем протирают поверхность плотной среды во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Чашки инкубируют при оптимальной для микробов температуре (чаще всего - 37°С) до 2-х суток. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микробов, тогда как в последующих - изолированные колонии.

Рассеивать накопительную культуру можно методом истончающегося штриха. В этом случае накопительную культуру или её разведение отбирают петлей и проводят штрихи по плотной питательной среде в чашке Петри в определенном порядке. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют. Чашки термостатируют 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизма. Выросшие изолированные колонии методом штриха отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной среды или в жидкую среду.

Изолированные колонии анаэробов и факультативных анаэробов получают методом глубинного посева. С этой целью в пробирки с расплавленной питательной средой, охлажденной до 40-37°С, высевают по 0,5-1,0 мл разведения исследуемого материала с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Среду быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение агаризованной среды с посевом. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении в пробирке или пипетке вырастают изолированные колонии. Для их извлечения пробирку (или пипетку) слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки или быстро опустив в теплую воду, при этом агар, прилегающий к стенке, плавится и содержимое столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным скальпелем и извлекают колонии, захватывая их стерильной капиллярной пипеткой или петлей. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычис­лить, когда этот...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: