Экспресс-методы определения функциональной активности микрофлоры рубца

Проба с метиленовым синим (по G. Dirksen). Принцип. Красящее вещество — метиленовый синий, введенное в содержимое рубца (in vitro), обесцвечивается, восстанавливаясь ферментами микроорганизмов.

Реактив: 0,03%-ный раствор метиленового синего.

Оборудование: водяная баня; пробирки или химические стаканчики; стеклянные палочки; секундомер или часы.

Ход определения. В пробирку или химический стаканчик на 20 мл наливают 10 мл свежевзятого содержимого рубца, приливают 0,5 мл (в стаканчик 1 мл) 0,03%-ного раствора метиленового синего и перемешивают стеклянной палочкой. Параллельно ставят контрольную пробу без добавления метиленового синего. Пробирки (стаканчики) перемещают на водяную баню при температуре 38 0C и контролируют время обесцвечивания красящего вещества, сравнивая опытную пробу с контрольной.

У здорового крупного рогатого скота при смешанном типе кормления обесцвечивание наступает за 3 мин. Если же обесцвечивание продолжается 15—17 мин, необходимо обратить внимание на кормление животных (качество корма и режим кормления). Увеличение времени обесцвечивания раствора метиленового синего до 30 мин и более свидетельствует о заболевании преджелудков.

Проба со сбраживанием глюкозы. Принцип. Легкоперевари-мые углеводы, поступающие с кормом в рубец, активно ферментируются микрофлорой до ЛЖК и газов (углекислый, метан, водород). Добавляя глюкозу к содержимому рубца (in vitro), фиксируют активность газообразования и таким образом делают выводы о ферментативной способности микроорганизмов.

Реактив: свежеприготовленный 16%-ный раствор глюкозы.

Оборудование: сахарометр или градуированные пробирки; термостат.

Ход определения. В сахарометре или градуированной пробирке смешивают 10 мл свежего содержимого рубца с 0,5 мл 16%-ного слегка подогретого раствора глюкозы и-ставят в термостат при температуре 38 °С. Интенсивность ферментации глюкозы определяют через 30 и 60 мин по величине образованной прослойки газов.

В содержимом рубца здорового крупного рогатого скота при сбраживании глюкозы газовая прослойка толщиной 1 см образуется в течение 30 мин, а через 60 мин она достигает 2 см. При инактивации микрофлоры (ацидоз, алкалоз) количество образовавшихся газов незначительно или их нет совсем. При тимпании рубца газообразование значительно возрастает.

Проба с восстановлением нитратов. Принцип. Внесение калия нитрата в содержимое рубца (in vitro) вызывает его восстановление микроорганизмами и использование азота, характеризующееся исчезновением красного цвета.

Реактивы: 0,025%-ный раствор калия нитрата (KNO3);

реактив 1: 2,0 мл концентрированной серной кислоты смешивают с 200 мл 30%-ного раствора уксусной кислоты;

реактив 2: 0,6 мл а-нафтилина, 16,0 мл концентрированной уксусной кислоты смешивают со 140 мл дистиллированной воды.

Оборудование: водяная баня; пробирки; пластина с ячейками.

Ход определения. ВЗ пробирки наливают по 10 мл содержимого рубца. В первую пробирку вносят 0,2 мл, во вторую 0,5 мл и при необходимости в третью 0,7 мл 0,025%-ного раствора калия нитрата. Пробирки ставят в водяную баню при температуре 39 °С. Через 5 мин из каждой пробирки берут по 1 капле смеси и наносят на пластинку с ячейками. Затем добавляют по 2 капли реактивов 1 и 2. Если восстановление нитратов не наступило, то смесь окрашивается в красный цвет. В случае расщепления калия нитрата микрофлорой в течение 5 мин окрашивание не появляется. При появлении красного цвета продолжают контролировать время обесцвечивания поминутно.

В содержимом рубца здоровых животных KNO3 восстанавливается через 5—10 мин в первой пробирке и через 20 и 30 мин соответственно во второй и третьей. При нарушении ферментативной активности микрофлоры (ацидоз, алкалоз, атонии, гипотонии) время восстановления затягивается или же восстановления вообще не происходит.

Определение целлюлолитической активности микрофлоры. Расщепление грубого корма у жвачных происходит ферментами цел-люлолитических микроорганизмов, которые заселяют рубец во время поедания первых порций сена (примерно в двухнедельном возрасте). Уже в 2—3-месячном возрасте отмечают максимальную целлюлолитическую активность микроорганизмов. Расщепление клетчатки приводит к образованию ЛЖК — источника энергии животных. В преджелудках усваивается 60—70 % клетчатки.

Принцип базируется на способности целлюлолитической микрофлоры переваривать хлопчатобумажную нить (in vitro).

Реактив: 16%-ный раствор глюкозы.

Оборудование: термостат; пробирки; стеклянный шарик; натуральная хлопчатобумажная нить № 10 (искусственную или полусинтетическую не используют).пионовой и масляной кислотами уменьшается у больных до 1,04 ± + 0,08 по сравнению с 1,37 ± 0,09 у здоровых.

Ход определения. В пробирке смешивают 10 мл свежевзя-того содержимого рубца и 0,3 мл 16%-ного раствора глюкозы. К концу хлопчатобумажной нити привязывают стеклянный шарик и опускают на дно пробирки с содержимым рубца. Противоположный конец нити фиксируют вокруг внешнего края пробирки. Пробу помещают в термостат при 39 °С и через 12 ч проводят первый контроль. Содержимое рубца переваривает нить в течение 96 ч. Если за это время переваривание не произошло, целлюлолитическая активность считается отрицательной.

Определение амилолитической активности содержимого рубца. Определение амилолитической активности содержимого рубца базируется на принципе расщепления крахмала микробной амилазой; фотоэлектроколориметрический анализ проводится по цветной реакции крахмала и йода.

Реактивы: 6,25%-ный раствор крахмала (готовится непосредственно перед использованием). В колбочку на 250 мл отвешивают 6,25 г водорастворимого крахмала и доливают 80 мл дистиллированной воды. После образования суспензии крахмала колбочку 10 мин выдерживают в кипящей водяной бане (до полного растворения крахмала), часто встряхивая. Раствор крахмала, охлажденный до комнатной температуры, переносят в мерную колбочку на 100 мл и доводят объем кипяченой дистиллированной водой до метки; фосфатный буфер, рH 6,8; 2 н. раствор хлористоводородной кислоты (HCl); раствор калия йод-йодистого. Растворяют 20 г калия йодида и 2 г кристаллического йода віл дистиллированной воды.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; мерные колбы на 50 мл.

Ход определения. В пробирке смешивают 1,6мл 6,25%-ного раствора крахмального субстрата с 7,4 мл фосфатного буфера. После 10-минутного нагревания пробирки в водяной бане при 40 °С добавляют 1 мл жидкости рубца, процеженной через 2 слоя марли. Содержимое пробирки тщательно взбалтывают и сразу же пипеткой переносят 0,5 мл этой жидкости в мерную колбу на 50 мл с 2 мл 2 н. раствора HCl для прекращения действия микробных ферментов. В колбу добавляют 2 мл раствора калия йод-йодистого и дистиллированной водой доводят объем до 50 мл (проба до инкубации). После этого пробирку выдерживают 1 ч в водяной бане при температуре 40 °С, периодически (через 10—15 мин) перемешивая содержимое пробирки встряхиванием. По завершении инкубации из пробирки отбирают пробу 0,5 мл и переносят в мерную колбочку на 50 мл с 2 мл 2 н. раствора HCl. Добавляют 2 мл калия йод-йодистого и дистиллированную воду до метки (проба после инкубации).

Полученные растворы проб до инкубации и через 1 ч после нее исследуют на ФЭКе в кюветах на 5 мм при красном светофильтре (620 нм) против дистиллированной воды.

Расчет. По калибровочной кривой определяют количество крахмала (мг) в растворах до инкубации и после нее. Разница между этими показателями дает количество крахмала, расщепленного микробной амилазой за 1 ч инкубации. Амилолитическая активность выражается формулой

X = (А - В) • 20,

где X — количество крахмала, расщепленного 1 мл содержимого рубца за 1 ч, мг; А — количество крахмала в растворе до инкубации, мг; В — количество крахмала после инкубации, мг; 20 — коэффициент перерасчета на 1 мл содержимого рубца.

Определение протеиназной активности содержимого рубца.

Принцип. При pH больше 5,0 а-аминокислоты реагируют с нингидрином с образованием углекислоты, альдегида и соединения, окрашенного в синий цвет, которое характеризуется максимальным поглощением при длине волны 597 нм. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству аминокислот.

Реактивы: фосфатный буфер, pH 7,1; цитратный буфер, pH 5,4; 2%-ный раствор казеина, приготовленный на 0,5%-ном растворе Na2CO3; 0,5%-ный раствор натрия карбоната; 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; 0,01 н. раствор кислоты хлористоводородной (HCl); 60%-ный раствор глицерина; 1%-ный раствор нингидрина (растворяют при подогревании в цитратном буфере; реактив темного цвета необходимо очищать); раствор «С»: к 40 мл 60%-ного глицерина добавляют 100 мл 1%-нингидрина и 40 мл цитратного буфера (готовят перед анализом).

Ход определения. В одну пробирку (опыт) вносят 4 мл раствора казеина, 1 мл фосфатного буфера и помещают в водяную баню при температуре 30 °С. Через 10 мин добавляют 1 мл разведенного в 5 раз дистиллированной водой содержимого рубца (1 + + 4), смешанного и инкубированного при 30 0C в течение 60 мин. Добавляют 4 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции. Взбалтывают 10 мин, центрифугируют или фильтруют (фильтрат должен быть прозрачным).

Набирают 0,2 мл фильтрата или аликвота, добавляют 3,8 мл раствора «С», пробирки закрывают притертыми стеклянными пробками и ставят в кипящую водяную баню на 20 мин.

Пробы, окрашенные в синий цвет, охлаждают в проточной воде и фотометрируют через 10—15 мин на приборе с красным светофильтром в кювете на 10 мм. Интенсивность окраски сохраняется в течение 1 ч.

В контрольную пробирку вносят 1 мл разведенного содержимого рубца, 1 мл фосфатного буфера, 4 мл трихлоруксусной кислоты, выдерживают 10 мин в водяной бане при температуре 30°С. После этого вносят 4 мл раствора казеина, смешивают и фильтруют. Затем исследуют так же, как опытную пробу.

Количество свободного аминного азота определяют по калибровочному графику. Для его построения берут стандартные растворы тирозина или глицина и готовят ряд растворов, которые содержат различное количество этих аминокислот (мкмоль), и дальше реакцию проводят так же, как описано выше. Активность фермента выражают в микромолях аминного азота глицина или тирозина за 1 мин на 1 г ферментного препарата (содержимого рубца), что соответствует 1 ед. активности:

Определение липолитической активности содержимого рубца.

Принцип. Содержимое инкубируют с приготовленной эмульсией подсолнечного масла. Показателем активности ферментов является количество освобожденных свободных жирных кислот. Реактивы: подсолнечное масло;

0,6%-ный раствор цистеина солянокислого или аскорбиновой кислоты; желчь; 20%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты; 0,01 н. раствор NaOH; раствор Рингера—Локка: 9 г NaCl, 0,2 г NaHCO3, 0,2 г CaCl2, 0,2 г KCl, 1 г глюкозы и воды дистиллированной до 1 л; индикатор Таширо: 40 мл 0,1%-ного спиртового раствора метилового красного и 10 мл 0,1%-ного спиртового раствора метиленового синего.

Оборудование: термостат; холодильник; бюретка; колбочки на 100 мл с притертыми пробками.

Ход определения. Содержимое рубца хорошо перемешивают и готовят разведение 1:10. Готовят субстратную смесь: 3 мл подсолнечного масла, 3 мл раствора Рингера—Локка, 1 мл 0,6%-ного раствора цистеина солянокислого и 3 капли желчи.

В колбочки на 100 мл (2 опытные и 2 контрольные) с притертыми пробками набирают по 3 мл раствора Рингера—Локка и 1 мл содержимого рубца. Опытные пробы ставят в термостат при температуре 39 °С на 5 ч, контрольные — в холодильник. Через каждый час пробы встряхивают 5 мин. Через 5 ч добавляют в колбочки по 3 капли 20%-ного раствора фосфорновольфрамовой кислоты и опытные пробы помещают в холодильник. Содержимое колбочек фильтруют в пробирки, добавляют по 1 капле индикатора Таширо. Опытные и контрольные пробы тестируют 0,01 н. раствором NaOH до розового цвета.

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычис­лить, когда этот...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: