Принцип метода секвенирования ДНК.

Секвенирование – комплекс методов направленных на расшифровку аминокислотной или нуклеотидной последовательности биополимеров. Секвенирование ДНК – прочтение нуклеотидной последовательности первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты.

В основе реакции секвенирования лежит принцип удлинения новосинтезированной цепи ДНК на изучаемой матрице.

При секвенировании геномной ДНК всегда следует помнить, что получаемая картина отражает нуклеотидную последовательность обоих аллелей изучаемого фрагмента гена.

Для обнаружения мутаций секвенируются только экзоны изучаемого гена.

В настоящее время техника секвенирования ДНК значительно усовершенствовалась благодаря внедрению в практику лазерно-флюоресцентных автоматических секвенаторов – специальных приборов, осуществляющих детекцию продуктов реакции в геле путем регистрации интенсивности их флюоресценции.

125.Метод полимеразной цепной реакции. Применение в биологии и медицине.

В настоящее время большинство протоколов прямой ДНК-диагностики базируется на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаружить в пробе всего одну молекулу ДНК. Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий искомого участка ДНК, достаточного для достоверной визуализации. Амплификацию (умножение) нуклеотидной последовательности ДНК катализирует ДНК-полимераза. Процесс репликации искомого фрагмента ДНК обуславливают генспецифические праймера – ДНК-олигонуклеотиды, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК. Праймеры (20-30 нуклеотидных пар) служат затравками для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи ДНК. Длина амплифицируемого участка синтезируемой ДНК ограничена праймерами и обычно составляет несколько сот п.н. при этом каждая вновь синтезированная цепь ДНК (амплификон) служит матрицей для синтеза новой цепи комплементарной ДНК. Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК требуется от 20 до 30 циклов ПЦР, характеризующихся экспоненциальным увеличением числа копий специфического фрагмента ДНК. Каждый цикл реакции включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах.

Пцр используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах:

1) установление отцовства;

2) медицинская диагностика;

3) персонализированная медицина;

4) клонирование генов;

5) секвенирование ДНК;

6) мутагенез.

Принцип метода блоттинга по Саузерну. Применение в биологии и медицине.

Блоттингом (буквально - промакивание) называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или белка), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку - мембрану.

Зонд - короткая цепь одноцепочечной РНК, имеющая комплементарную определенному участку ДНК последовательность

Гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу.

В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране (Саузерн-блот гибридизация, Southern blot hybridization).

Геномную ДНК расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллгенома часть генома.

Метод.

1. Рестрикция эндонуклеазами рестрикции для разрезания высокомолекулярной ДНК на более мелкие фрагменты.

2. Фрагменты ДНК подвергаются электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине.

3. В случае, если некоторые фрагменты ДНК длиннее 15 кб, перед переносом гель обрабатывают, например, соляной кислотой, которая вызывает депуринизацию ДНК и облегчает перенос на мембрану.

4. В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирует и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.

5. Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют непосредственно на гель или через несколько слоев бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий.

6. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80 °C в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран).

7. Осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченной пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной.

8. После гибридизации избыток пробы отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путём авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).

Значимость для медицины и биологии. Определение последовательностей ДНК различных видов, данный метод был одним из основных во время проекта "Геном человека".

Саузерн-блоттинг может быть использован для определения числа копий генов в геноме. Проба, которая гибридизуется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, дает одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что п роба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями. Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводят к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.

На пленке можно увидеть специфические радиоактивные полосы для каждого интересующего фрагмента ДНК человека на исходном геле.

Клонирование организмов.

Наибольшее внимание учёных и общественности привлекает клонирование многоклеточных организмов, которое стало возможным благодаря успехам генной инженерии. Создавая особые условия и вмешиваясь в структуру ядра клетки, специалисты заставляют её развиваться в нужную ткань или даже в целый организм. Допускается принципиальная возможность воспроизведения даже умершего организма, при условии сохранения его генетического материала.

Различают полное (репродуктивное) и частичное клонирование организмов. При полном воссоздаётся весь организм целиком, при частичном — организм воссоздаётся не полностью (например, лишь те или иные его ткани).

Репродукти́вное клони́рование предполагает, что в результате получается целый организм. Кроме научных целей оно может применяться для восстановления исчезнувших видов или сохранения редких видов.

Одно из перспективных применений клонирования тканей — клеточная терапия в медицине. Такие ткани, полученные из стволовых клеток пациента, могли бы компенсировать недостаток и дефекты собственных тканей организма и не отторгаться при трансплантации. Это так называемое терапевтическое клонирование.

Терапевти́ческое клони́рование предполагает, что в результате намеренно не получается целый организм. Его развитие останавливают заранее, а получившиеся эмбриональные стволовые клетки используют для получения нужных тканей или других биологических продуктов. Эксперименты показывают, что терапевтическое клонирование может быть с успехом применено для лечения некоторых заболеваний, считавшихся неизлечимыми.

Методы клонирования ДНК.

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить(клонировать).

Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.

Клонирование ДНК in vivo. Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).

Геномная библиотека (банк генов, клонотека) – это коллекция клонов ДНК, включающая все фрагменты, входящие в геном данного вида. Т. е. банк генов еще можно назвать набором клонированных фрагментов генома. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока. Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – ферментативная реакция, осуществляемая in vitro с помощью термостабильной ДНК-полимеразы на матрице ДНК с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка. ПЦР представляет собой серию из 3-х циклически повторяющихся реакций (обычно в сумме осуществляют 20—30 циклов): денатурация ДНК, отжиг ДНК-затравок с матрицей и синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы с каждой из затравок навстречу друг другу с использованием противоположных цепей ДНК в качестве матриц; по завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества анализируемой ДНК в геометрической прогрессии, что позволяет в миллионы раз увеличивать количество изучаемого фрагмента ДНК в пробе.

129. Клонирование генов.

Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- или эукариотических. С информационной РНК, выделяемой из однотипных клеток организма, снимают ДНК-копии (кДНК), которые затем вводят в реципиентные клетки, и амплифицируют. Клонирование ДНК in vivo включает 6 этапов:

1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции;

2) рекомбинация фрагментов,

3) вставка фрагмента ДНК в вектор;

4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;

5) скрининг на рекомбинантный вектор

6) отбор интересующих исследователя клонов.

Реципиентные клетки – клетки, выбранные для клонирования гена, могут быть как про-, так и эукариотическими.

мРНК выделяют из клеток или тканей, в которых экспрессируется искомый ген.

Синтез ДНК - копий осуществляется ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Чтобы этот фермент начал работать, требуется короткая одноцепочечная ДНК-затравка; для этой цели, как правило, используют oligo(dT). Затравочная ДНК самопроизвольно образует двухцепочечный комплекс с отрезком poly(dA).

Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНКустойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Получившаяся в результате ДНК является одноцепочечной.

Двухцепочечную (дц) кДНК получают путем достраивания оц-кДНК до двухцепочечной формы, выполняемого ферментом ДНК-полимеразой I. Такую кДНК можно встраивать в вектор.

Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.

Плазмиды — это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутые кольцевые молекулы дц-ДНК. Чтобы включить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо «разомкнуть». Для этого плазмиды подвергают воздействию рестриктаз.

Рестриктаза - разрезает дц-ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, называемым участками рестрикции.

Сшивание (лигирование) — процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между (или сшивается с двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента, называемого ДНК-лигазой.

Трансформация происходит после того, как рекомбинантную плазмиду добавляют к бактерии-реципиенту: плазмида проникает внутрь бактерии и включается в ее жизненный цикл.

Скрининг («просеивание») — это процедура, необходимость применения которой обусловлена тем, что в исходном препарате кДНК представлено много разных мРНК и лишь часть плазмид несет нужный нам ген.

Амплификация осуществляется благодаря тому, что в одной бактериальной клетке может синтезироваться много копий интересующей нас плазмиды, а также за счет получения большого количества клеток с такими плазмидами. После выделения и очистки плазмиды обрабатывают соответствующей рестриктазой, которая вырезает встроенные в них копии искомого гена. Амплифицированный таким образом ген можно использовать для дальнейших экспериментов в области генной инженерии.

130.Генетически модифицированные организмы.

Генетически модифицированный организм (ГМО) - организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии (растения, животные и микроорганизмы).

Генная инженерия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма, осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования.

Основным видом генетической модификации в настоящее время является использование трансгенов для создания трансгенных организмов.

Трансген — фрагмент ДНК, переносимый при помощи генно-инженерных манипуляций в геном определённого организма с целью модификации его свойств. Трансген может быть выделен из биологического объекта или синтезирован искусственно.

Трансге́нный органи́зм — живой организм, в геном которого искусственно введен ген, который не может быть приобретен при естественном скрещивании.

Основные этапы создания ГМО:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

Вектор - молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке. Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Применение:

В медицине: при помощи трансгенной бактерии производится человеческий инсулин.

В фармацевтической промышленности: выпускается большое количество лекарственных средств на основе рекомбинантных белков человека

В сельском хозяйстве: для создания новых сортов растений, устойчивых к неблагоприятным условиям среды и вредителям, повышение урожайности.

А также: разрабатываются генетически модифицированные бактерии, способные производить экологически чистое топливо.

 

Генетически модифицированная пища - это продукты питания, полученные из генетически модифицированных организмов (ГМО). Большинство культивируемых генно-модифицированных организмов обладают устойчивостью к возбудителям болезней (к вирусам и грибам), насекомым-вредителям или к гербицидам.

 

131. Структура генома.

Геном - вся совокупность молекул ДНК клетки (в случае ряда вирусов говорят о геномной РНК).

Существует ядерный геном, митохондриальный геном и геном пластид. Соматические клетки содержат диплоидный (2n) геном, половые - гаплоидный (n).

Прямой корреляции между количеством ДНК и эволюционной продвинутостью организма нет.

Так, например, у малярийного плазмодия 0.06 пг ДНК в ядре, а у амебы 490 пг. Большое количество ДНК не обязательно приносит качественно новую информацию. Амеба пошла на увеличение количества ДНК для увеличения размеров ядра и самой клетки. Генов у нее меньше, чем у плазмодия, но они копированы много раз. У малярийного плазмодия генов больше, чем у амебы, а ДНК меньше для максимальной компактности. Малые размеры ядра и самого одноклеточного организма позволяют ему быть внутриклеточным паразитом.

"Избыточность" эукариотического генома

На ~ 10⁶ пар нуклеотидов у бактерий приходится ~5 тыс. генов. На ~10⁹ пар нуклеотидов у млекопитающих ~50 тыс. генов.

Минусы "избыточной" ДНК:

- увеличение времени синтеза ДНК;

- cложнее организовывать удвоение ДНК;

- высокая энергоемкость - на 1 нуклеотид для включения в цепь ДНК нужно затратить ~60 молекул АТФ.

Неопределенное следствие:

- благодаря зависимости размера ядра от количества ДНК происходит увеличение размеров клетки.

Плюсы "избыточной" ДНК:

- возникает возможность создания сложного регуляторного аппарата, позволяющего поднять организм на более высокий эволюционный уровень.

Причины избыточности:

1. Большой размер генов (за счет наличия интронов).

2. Присутствие повторенных последовательностей. Повторяются и гены, и некодирующие участки. У эукариот некоторые последовательности повторены сотни и тысячи раз.

3. Наличие большого числа некодирующих последовательностей, часть из которых выполняет регуляторную функцию при транскрипции, а часть - необходима для компактизации генома.

⇐ Предыдущая3456789101112Следующая ⇒

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

---

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: