Д.А. Васильев С.Н. Золотухин Е.А. Корнеев

РУКОВОДСТВО К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ

Руководство к практическим занятиям по микробиологии.

Второе издание расширенное и дополненное.

Предназначено студентам факультетов: ветеринарной медицины и биотехнологии

Издается по решению методической комиссии факультета ветеринарной медицины УГСХА, протокол № 11 от 16.04.1997 г.

Рецензент: кандидат ветеринарных наук, доцент курса

Необходимость создания руководства к практическим занятиям по микробиологии возникла примерно 6 лет назад и была обусловлена проявлением специализаций на факультетах ветеринарной медицины и биотехнологии. Поэтому в 1998 году нашими силами (Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин) был создан и издан практикум справочник по общей и частной микробиологии для студентов по специализации врач – бактериолог общим объёмом в 22 печатных листа. Однако студенты учащиеся по специализация – технолог-переработчик и на специальности – биотехнология изучали курс общей микробиологии по старым практикумам, не всегда совпадающим с учебными программами. Это вызывало некоторые неудобства в проведении практических занятий, создавало дополнительные методические трудности.

Преподавание микробиологии в нашем вузе на двух факультетах - ветеринарном и зооинженерном, опирается на опыт московской школы микробиологов. В середине пятидесятых годов, аспирант профессора Колякова Я.Е (являвшийся несколько десятилетий заведующим кафедрой микробиологии МВА, и автором учебников микробиологии, по которым четверть века учились студенты ветеринарных факультетов) – доцент и руководитель курса микробиологи А.П. Васильев приехал в Ульяновск и создал солидную теоретическую и практическую базу курса микробиологии в УГСХА. Он подготовил преемника в лице своего аспиранта, а в последующем профессора, доктора ветеринарных наук В.Я. Ганюшкина, аспирант которого, а ныне доцент, С.Н. Золотухин, является в настоящее время руководителем курса микробиологии. Учитывая полувековой опыт преподавания микробиологии коллективом кафедры, представляющим одну научно-педагогическую школу, было решено создать так называемый малый практикум по микробиологии. Это практически базовый практикум, первый этап знакомства с миром микроорганизмов. В дальнейшем студенты, изучающие микробиологию по специальности ветеринарный врач, продолжают изучать микробиологию по существующему лабораторному практикуму…., студенты по специализации врач – бактериолог изучают микробиологию по выше упомянутому большому лабораторному практикуму, студенты по специализации технолог–переработчик, изучают микробиологию по созданному на нашей кафедре лабораторному практикуму по микробиологии мяса и молока. Этим же практикумом пользуются студенты, изучающие специализацию врач– ветсанэксперт. При составления руководства авторы исходили из принятого на кафедре метода проведения практических занятий. В основе которого лежит принцип самостоятельной работы студентов. Это позволяет преподавателю не излагать весь рассматриваемый материал, а лишь проверить подготовленность группы к занятиям и осветить наиболее сложные вопросы предстоящей работы.

Все замечания и предложения, которые могут возникнуть при чтении руководства и работы с ним авторы примут с благодарностью. Дополнительную информацию можно получить на нашем сайте в Интернете – www.Miсrobiology.by.ru

ЗАНЯТИЕ 1. Бактериологическая лаборатория, ее задачи. Техника безопасности в лаборатории. Устройство микроскопа. Особенности микроскопии в микробиологической практике (иммерсионная система). Формы микроорганизмов.

Цель занятия. Усвоить правила работы в бактериологической лаборатории. Ознакомиться с техникой безопасности и личной профилактикой. Освоить работу с микроскопом и особенности иммерсионной системы. Изучить формы бактерий.

Материалы и оборудование. Микроскопы, окрашенные микроскопические препараты с различными формами микроорганизмов, плакаты.

Методические указания. После краткого объяснения преподавателя о порядке проведения работы в лаборатории, необходимости соблюдения техники безопасности студенты знакомятся с устройством светового микроскопа, осваивают технику микроскопии готовых препаратов, изучают морфологию микроорганизмов на препаратах и зарисовывают их в тетради.

Бактериологическая лаборатория - это учреждение ветеринарной службы, деятельность которой направлена на ликвидацию заразных болезней животных, а также охрану населения от болезней общих для животных и человека. По масштабу работы ветеринарные лаборатории бывают: районные, межрайонные (зональные), областные (краевые) и республиканские. Основная задача бактериологических лабораторий - диагностика болезней сельскохозяйственных животных (включая птиц), пушных зверей, рыб, пчел, а также проведение экспертизы пищевых продуктов и кормов, санитарной оценки воды, воздуха и почвы.

Лабораторию размещают в отдельном здании, вдали от проезжих дорог. В ней предусматривают приемное отделение, бактериологический, вирусологический, биохимический, серологический и патологоанатомический отделы; выделяют специальные помещения для стерилизации посуды и питательных сред, для мытья посуды. Для выполнения работы в асептических условиях оборудуют специальные изолированные помещения - боксы. Лабораторных животных размещают в виварии. Кроме того, имеются комнаты для специалистов, обслуживающего персонала, кабинет заведующего, помещения для библиотеки, склада, весовой, раздевалки и др.

Учебная микробиологическая лаборатория предназначена для овладения студентами методами выделения и изучения различных микроорганизмов. В ней проводятся лабораторные занятия, предусмотренные программой, а также научно-исследовательская работа.

1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и обмывают мазок водой.

2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в течение 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.

6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором 1: 1000 малахитовой зелени или метиловой зелени.

7. Краску смывают водой и препарат высушивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки - рубиново красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото - и спиртоустойчивых сапрофитов, - синие. Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл+96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой и т. д. по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото - и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото - и спиртоустойчивы.

Стерилизация предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых микроорганизмов, и проводят её различными способами: паром, сухим горячим воздухом, кипячением, фильтрацией и т. д. Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта.

Подготовка и стерилизация лабораторной посуды. Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрицы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки. Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1— 10 штук. Пастеровские пипетки по 3—15 шт. заворачивают оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в рот. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2—2,5 см и длиной 50—70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерилизуют в них.

Лабораторную посуду стерилизуют: а) сухим жаром при температуре 175°С 1 ч., б) в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 20— 30 мин.

Стерилизация шприцев. Шприцы стерилизуют в разобранном виде: отдельно цилиндр и поршень в 2% растворе гидрокарбоната натрия 30 мин. При работе со спороносной микрофлорой стерилизацию производят в автоклаве при 132±2°С (давл. 2 атм.) в течение 20 мин, при 126±2°С (давл. 1,5 атм.)— 30 мин. Простерилизованный шприц собирают после того, как он остынет, в цилиндр вставляют поршень, надевают иглу, предварительно вынув из нее мандрен. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем.

Стерилизация металлических инструментов. Металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты и пр.) стерилизуют в 2% растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины и потерю остроты. Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в раствор рекомендуется обертывать ватой.

Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные петли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования. Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не произошло разбрызгивания сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Прокаливание в целом занимает 5—7 секунд.

Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 мин.

Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нужной величины. После этого каждый вид материала в отдельности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета простерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.

Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Изделия из резины (перчатки, трубки и т. д.), загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в течение 30 мин; при загрязнении спороносной микрофлорой—в автоклаве при давлении 1,5—2 атм. в течение 30 или 20 мин. Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и снаружи пересыпают тальком для предохранения их от склеивания. Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде помещают в биксы.

Стерилизация культур микробов. Пробирки и чашки, содержащие культуры микробов, не нужные для дальнейшей работы, складывают в металлический бак, пломбируют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры микробов, вегетативные формы, убивают в автоклаве в течение 30 мин при давлении 1,5 атм. Сдача баков для стерилизации в автоклавную производится специально выделенным лицом под расписку. Режим стерилизации регистрируется в специальном журнале. ВИДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ. Стерилизация кипячением производят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. (Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы—в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия). Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами. Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обогрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150°С 2 ч, при 165°С—1 ч, при 180°С—40 мин, при 200°С—10—15 мин (при 170°С бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются). Началом стерилизации считается тот момент, когда температура в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде. Стерилизация паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутренний — стерилизационной камерой. В водопаровом котле происходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые проходит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава герметически привинчивается к кожуху. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомерное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Манометр служит для определения давления, создающегося в стерилизованной камере. Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимается за нуль, поэтому в неработающем автоклаве стрелка манометра стоит на нуле. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость. Красная черта на шкале манометра определяет максимальное рабочее давление, которое допускается в автоклаве. Предохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерного повышения давления. Его устанавливают на заданное давление, т. е. давление, при котором нужно производить стерилизацию, при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления. На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло, показывающее уровень воды в водопаровом котле. На трубке водомерного стекла нанесены две

1 - воронка, через которую автоклав заправляют водой; 2 - предохранительный клапан; 3 - манометр; 4 - крышка автоклава; 5 - водопаровая камера; 6 - кран для выпуска воздуха; 7 - отверстие, через которое пар поступает в стерилизационную камеру; 8 -стерилизационная камера; 9 - подставка для размещения стерилизуемых материалов

горизонтальные черты — нижняя и верхняя, обозначающие соответственно допускаемый нижний и верхний уровень воды в водопаровой камере. Воздушный кран предназначен для удаления воздуха из стерилизационной и водопаровой камер в начале стерилизации, так как воздух, являясь плохим проводником тепла, нарушает режим стерилизации. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала. Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медленно ослабляют прижимные приспособления и открывают крышку (дверь) автоклава. Температура и продолжительность стерилизации определяются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен. Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколько небольших отверстий для выхода пара. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют главным образом питательные среды, свойства которых изменяются при температуре выше 100°С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при температуре 100°С не обеспечивает полного обеспложивания. Такой метод получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 мин ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Тиндализация- дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60—65°С в течение 5 дней или при 70— 80 C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при температуре 25°С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.

Механическую стерилизацию с помощью бактериальных фильтров применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий, а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзотоксинов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как стерилизацию в принятом значении этого слова. Для изготовления фильтров применяют мелкопористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), способные задерживать бактерий. Асбестовые фильтры (фильтры Зейтца) представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3—5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: “Ф” (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерий, и “СФ” (стерилизующие), более плотные, задерживающие бактерий. Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в автоклаве. Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливают из нитроклетчатки и представляют собой диски белого цвета. Непосредственно перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50— 60°С, чтобы предупредить их скручивание, кипятят на слабом огне в течение 30 мин, меняя 2—3 раза воду. Простерилизованные фильтры во избежание их повреждения вынимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.

Для фильтрации жидкостей монтируют в специальные фильтровальные приборы: в частности Зейтца. Он состоит из 2-х частей: верхней, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней - опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или чистой керамической пластинки, на которую помещают мембранный или асбестовый фильтр. Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов. Перед началом фильтрации, места соединения различных частей установки, для создания герметичности, заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной резиновой трубкой к водоструйному, масляному или велосипедному насосу. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос, создающий вакуум в приёмном сосуде. В результате образующей разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приёмник. Микроорганизмы остаются на поверхности фильтра.

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шёнлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства ее временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы органогены: азоты, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды. По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка. Источником углерода для бактерий являются главным образом различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли. Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH₂P0₄, K₂HP0₄ и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины. Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды. Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из; жидких питательных сред посредством прибавления к ним клеевых веществ агара или желатина. Агар-агар (по-малайски желе) - продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80 - 86° С, застудневает при 36 - 40° С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенных микробов при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин—вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.

Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны:1. Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества. 2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. 3. Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса. 4. Обладать изотоничностью. 5. Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные. К первой группе относятся мясопептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба. К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строго значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом: 1. Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т. п. 2. Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами. 3. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов. 4. Среды для определения редуцирующей способности микробов. В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке. Постоянство состава, стандартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуществом сухих питательных сред. После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав. 1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С. 2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112° С. 3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием. 4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца. Подготовленные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37° С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром -3 сут.

ЗАНЯТИЕ 6. Методы и техника культивирования микроорганизмов на питательных средах. Методы выделения чистых культур микроорганизмов. Изучение культуральных свойств микроорганизмов.

Цель занятия. Изучить способы посевов и пересевов микроорганизмов на питательные среды. Изучить методы выделения чистых культур микроорганизмов. Ознакомиться с формами колоний. Произвести посев культур микробов на МПБ и МПА (в пробирки), а также посев смеси микробных культур (для выделения чистых) методом рассева на чашки Петри с МПА.

Оборудование и материалы. Штативы, пробирки со средами, микробиологические петли, шпатели, пипетки, чашки Петри с МПА. Культуры микроорганизмов.

Имеется несколько методов микробиологического исследования воздуха, но наиболее простым из них является седиментационный - оседание микробов по Коху. При использовании этого метода чашки Петри с питательной средой открывают на 5 мин, а иногда и на более продолжительное время (в зависимости от загрязнения) в том помещении, где необходимо определить чистоту воздуха. Чашки закрывают и ставят в термостат при температуре 30—35⁰С на 2—3 сут. Подсчет колоний проводят на всей поверхности чашки. Считают, что из каждой живой клетки вырастает колония. Примерно на площади 100 см в течение 5 мин оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха, а в 1 м³ в 100 раз больше.

Загрязненность воздуха микробами можно оценить также фильтрационными методами. Один из них предложен Дьяковым. По этому методу определенный объем воздуха пропускают через стерильную питательную среду (мясопептонный бульон) или изотонический раствор натрия хлорида и стеклянные бусы. После тщательного перемешивания среды и проникших в нее микробов воздуха 1 мл такой смеси вносят в стерильную чашку Петри. Заливают расплавленным и охлажденным до 40—45⁰С мясопептонным агаром, среду равномерно распределяют вращательными движениями по дну чашки и оставляют до уплотнения. Чашки, перевернутые вверх дном, помешают в термостат при температуре35—37⁰С. Через 2—3 сут подсчитывают выросшие колонии. Учитывая количество пропущенного воздуха и объем среды, определяют число живых микробных клеток в 1 м³ воздуха.

Вместо жидкой среды для определения микробов в воздухе можно использовать сухие сыпучие вещества (порошок сахара), которым и заполняют стерильные стеклянные трубки. После пропускания определенного объема воздуха через такую трубку порошок сахара растворяют в 5 мл стерильной воды и 1 мл полученного раствора высевают в чашку с мясопептонным агаром. Количество микробов в 1 м ³ определяют с учетом прошедшего воздуха, разведения и объема высеянного раствора.

На поверхности зерна обитает разнообразная микрофлора. Часть микроорганизмов попадает туда из ризосферы, часть заносится с пылью и насекомыми. Однако на зерне, как и на всей поверхности растений, развиваются лишь некоторые микроорганизмы, так называемые эпифиты. Эпифитные микроорганизмы, размножающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений, получили название микроорганизмов филлосферы. Эпифиты питаются продуктами экзосмоса растений; устойчивы к высоким концентрациям фитонцидов, выдерживают периодич<

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: