Препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу

Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М с рН 7,4^*; пируват натрия, раствор 2∙10^-2 М на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4; НАД∙Н динатриевая соль, свежеприготовленный 6∙10^-3 М раствор в дистиллированной воде.

Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; стеклянная палочка; секундомер; СФ или ФЭК типа КФК-2.

Материал. Разведенный продажный препарат фермента 0,2 мкг/мл. Кристаллический препарат в виде суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония, имеющий активность около 200 ФЕ/мг белка, разводят в 1000 раз 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,4 перед опытом (1 ФЕ соответствует 1 мкмоль превращенного субстрата за 1 мин)[2].

Метод основан на непрерывном измерении скорости окисления НАД∙Н₂, используемого на восстановление пирувата в реакции, катализируемой ЛДГ. По уменьшению экстинкции НАД∙Н₂ при 340 нм рассчитывают количество превращенного субстрата за единицу времени. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимое превращение пирувата в лактат:

Равновесие реакции сдвинуто вправо, поэтому при изучении ЛДГ удобнее использовать в качестве субстрата пируват и НАД∙Н₂ и по скорости окисления последнего рассчитать активность этого фермента.

Ход определения. В кювету спектрофотометра последовательно вносят 2,4 мл фосфатного буфера, 0,2 мл раствора НАД∙Н₂ и 0,1 мл образца фермента. Перемешивают стеклянной палочкой и ставят в кюветодержатель.

Устанавливают шкалу отсчета экстинкции на 0,400 и ручкой «щель» выводят стрелку гальванометра (при открытой шторке) на нуль. В течение 1 мин проверяют отсутствие неферментативного окисления НАД∙Н₂ (в этом случае экстинкция не падает).

Добавляет в кювету 0,3 мл раствора пирувата натрия (запускают реакцию), быстро перемешивают, ручкой «щель» при открытой шторке возвращают стрелку гальванометра к нулевой отметке и включают секундомер.

Снимают показания экстинкции (падение ее, начиная от отметки 0,400) через каждые 30 с в течение 2-3 мин. Если условия реакции подобраны верно, то за каждые 30 с наблюдается примерно одинаковое уменьшение экстинкции.

Расчет. Удельную активность ЛДГ х (мкмоль∙мин^-1∙мг^-1) рассчитывают по формуле

где ∆Е_мин – изменение экстинкции в ходе реакции за 1 мин;

6,22 – коэффициент экстинкции 1 мкмоль НАД∙Н₂ в 1 мл среды;

1000 – коэффициент пересчета количества белка в миллиграммы.

Оформление работы. Рассчитать удельную активность ферментного препарата, молекулярную активность ЛДГ (учитывая, что ее молекулярная масса 135000). Сделать вывод о качестве исследуемого препарата (сохранность исходной активности, %).

Практическое значение работы. Принципы измерения активности лактатдегидрогеназы спектрофотометрическим методом непрерывного наблюдения используются при исследовании других ферментных препаратов, очищенных ферментов и в клинико-биохимических лабораториях при количественном определении активности ферментов в биологических жидкостях и биоптатах в норме и при патологии.

Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку

Реактивы. Лактат натрия, 0,45 М раствор или нейтрализованная гидроксидом натрия молочная кислота той же концентрации; пирофосфат натрия, 0,03 М раствор (Na₄P₂O₇∙10H₂O растворить в 50 мл воды, довести рН до 8,8 с помощью 1 М соляной кислоты и долить водой до 500 мл); НАД, свежеприготовленный раствор 3мг/мл; 2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 1 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор; пируват натрия, раствор для построения калибровочного графика (содержит 11 мкг пирувата натрия или 8,8 мкг пировиноградной кислоты в 1 мл).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; ФЭК; водяная баня с лабораторным термометром.

Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови:

Ход определения. Сыворотку крови разводят в 3 раза дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора НАД⁺ и ставят на 5 мин в водяную баню при 37˚С (для прогревания смеси).

Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 37˚С.

Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона).

К смеси приливают 5 мл раствора гидроксида натрия, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие им единицы активности ЛДГ, выраженные в ммоль/(ч∙л).

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделать вывод о возможном изменении активности и его причинах.

Практическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8-4,0 ммоль/(ч∙л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.

Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы

Фосфатазы – ферменты, отщепляющие фосфат от различных субстратов. Среди них имеются энзимы с неодинаковой специфичностью по отношению к субстратам. Щелочная фосфатаза действует в щелочной среде (чем отличается от фосфатаз, осуществляющих катализ в нейтральной или кислой средах) и является малоспецифичной.

Реактивы. β-Глицерофосфат, щелочной раствор на мединаловом буфере с рН 8,6^*; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония^*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты; дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г KH₂PO₄, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочной кривой).

Оборудование. Штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; ФЭК.

Метод основан на фотоколориметрическом определении неорганического фосфора, отщепляемого от β-глицерофосфата под действием фосфатазы сыворотки крови в щелочной среде:

Неорганический фосфат определяют по образованию фосфомолибдата аммония с последующим восстановлением его в молибденовую синь аскорбиновой кислотой (см. работу 11).

Ход определения. В две пробирки вносят по 1 мл раствора β-глицерофосфата и помещают на 5 мин в водяную баню при 37˚С. Затем в опытную пробирку добавляют 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают и отмечают время начала инкубации в водяной бане.

Через 1 час приливают в обе пробирки по 1,8 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную – еще 0,2 мл сыворотки крови. Перемешивают пробы, оставляют стоять 5 мин для осаждения белка. Центрифугируют содержимое обеих проб в течение 5 мин при 3000 об/мин.

Отбирают в чистые пробирки по 1,5 мл надосадочной жидкости (для определения в ней неорганического фосфата Ф_н) и приливают по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 мин измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб на ФЭКе, при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против раствора реактивов (1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1,5 мл дистиллированной воды).

По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие единицы щелочной фосфатазы, выраженные в ммоль/(ч∙л).

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины.

Практическое значение работы. В клинике используется определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови в основном у больных с поражениями костной ткани и печени, особенно с явлениями задержки оттока желчи. В норме активность фермента составляет 0,5-1,3 ммоль/(ч∙л). Повышение активности в сыворотке крови наблюдается при рахите (гиповитаминозе D), опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механической желтухе, вирусном гепатите и т.д., а снижение – при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др.

Изоферменты отличаются друг от друга несколькими физико-химическими признаками и, в частности, зарядом молекул, поэтому электрофорез издавна используется для их разделения. Изоферменты лактатдегидрогеназы были открыты одними из первых.

Различают пять типов изоферментов ЛДГ, которые в порядке подвижности к аноду обозначаются: ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Каждый из них представляет собой тетрамер, отличающийся составом субъединиц (см. учебник, с.226, 438).

Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы

Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.

Реактивы. Раствор № 1 для полимеризации геля с рН 8,9 (1,0 М соляная кислота – 48 мл, трис-основание – 36,6 г, N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин, или ТЕМЕД – 0,23 мл и дистиллированная вода до 100 мл); раствор № 2 (акриламид – 30,0 г, N,N-метиленбисакриламид – 0,8 г и дистиллированная вода до 100 мл); персульфат аммония, 0,14%-ный свежеприготовленный раствор; сахароза, 40%-ный раствор; электродный буфер с рН 8,9 (трис-основание – 6,0 г, глицин – 28,8 г, дистиллированная вода до 1 л; перед употреблением разводят в 10 раз); уксусная кислота, 7%-ный раствор; фосфатный буфер, 0,5 М с рН 7,4; лактат натрия, 1 М раствор; НАД, 10 г/л раствор; нитротетразолиевый синий (НС), 1 г/л раствор; феназинметасульфат (ФМС), 1 г/л раствор; хлорид магния, 0,005 М раствор; хлорид натрия, 0,1 М раствор.

Оборудование. Колба коническая вместимостью 25 мл; пипетки с оттянутым тонким концом; фильтровальная бумага; стеклянные палочки; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,5 и 10 мл; резиновые колпачки; аппарат для электрофореза со стеклянными трубочками; источник постоянного напряжения; микроденситометр; спектрофотометр или ФЭК.

Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана.

Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов № 1, № 2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. Смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.

Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги.

Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0.1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки.

Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером.

Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний к катоду (см. рис. 3). В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2 мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4 мА. Длительность электрофореза около 90 мин.

Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида магния, НАД – по 1 мл, фосфатного буфера и НС – по 2,5 мл и ФМС– 0,25 мл. Перемешивают содержимое колбочки.

По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки.

Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8 мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющую жидкость. Пробирки ставят в термостат при 37˚С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля.

По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте.

Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-85˚С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида.

Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке.

Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ:

где Е – экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящаяся к данному изоферменту;

А – активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л).

Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления.

Практическое значение работы. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментного спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом органов и тканей. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂ (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ₃, а в скелетной мышце и печени – ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ₁ – 32, ЛДГ₂ – 47, ЛДГ₃ – 12, ЛДГ₄ – 5, ЛДГ₅ – 4. При инфаркте миокарда в сыворотке крови увеличивается доля ЛДГ₁ и ЛДГ₂ (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови.

При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени.

При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ₃ в сыворотке крови.

Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы

Реактивы. L-γ-глутамил-п-нитроанилид; натрия хлорид; глицил-глицин^*; субстратно-буферный раствор^*; уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л; основной калибровочный раствор п-нитроанилида^*.

Оборудование. Пипетки на 0,1; 1,0 и 5,0 мл; термостатирующая водяная баня; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.

Метод основан на определении п-нитроанилида, образующегося из L-γ-глутамил-п-нитроанилида при ферментативном переносе L-γ-глутамилового остатка на глицил-глицин.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37°С. Через 5 минут приливают 0,05 мл сыворотки крови, содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 минут при температуре 37°С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Контрольную пробу ставят также как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации. Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭКе при длине волны 400-500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику.

Практическое значение работы. В клинике используется определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови в основном при заболеваниях печени и желчных путей. В норме активность составляет для мужчин 250-1767 нмоль/с·л (15-106 МЕ), для женщин – 167-1100 нмоль/с·л или 10-66 МЕ. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях желчных путей с явлениями обтурации, при гепатитах, опухолях и метастазах в печень. Следует отметить, что увеличение γ-глутамилтрансферазы, как правило, увеличивается параллельно активности щелочной фосфатазы, но активность γ-глутамилтрансферазы возрастает раньше, остается повышенной более длительное время и относительное увеличение активности фермента в несколько раз выше, чем щелочной фосфатазы. Следует отметить, что наркотики, седативные средства, этанол, стимулируют активность фермента, что используется для диагностики алкогольно-токсических заболеваний печени.

Пищеварение – это ферментативный гидролиз компонентов пищи. Для оценки его используются методы исследования активности ферментов и других компонентов пищеварительных соков, играющих вспомогательную роль в переваривании питательных веществ, например, соляная кислота, желчные кислоты, ионы кальция и т.д. Отклонения в составе пищеварительных соков или появление в них компонентов, не содержащихся в физиологических условиях, дают важную информацию о патологии пищеварения.

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: