Сдам Сам

ПОЛЕЗНОЕ


КАТЕГОРИИ







Работа 13. Химическая природа нуклеопротеидов





 

Нуклеиновые кислоты присутствуют во всех клетках (за исключением эритроцитов) организма человека в виде комплекса с белками, т.е. образуют нуклеопротеиды. Они в большом количестве содержатся в селезенке, зобной железе, печени и других органах и тканях, богатых ядрами. Из этих органов проще выделять и изучать нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты. Нуклеопротеиды делятся на дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП) и рибонуклеопротеиды (РНП), в которых фосфатные группы ДНК или РНК электростатически взаимодействуют с белками. Нуклеиновые кислоты – высокомолекулярные соединения, состоящие из мононуклеотидов, соединенных 3’, 5’- фосфодиэфирными связями. Они плохо растворимы в воде, образуя вязкие гелеподобные растворы. Хорошо растворимы в щелочах, растворах минеральных кислот и солей.

 

Реактивы. Хлорид натрия, 5%-ный раствор, содержащий 0,04% трехзамещенного цитрата натрия; гидроксид натрия, 0,4%-ный раствор; дифениламиновый реактив*; биуретовый реактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; ступка с пестиком; стеклянный порошок; пипетки; мерные цилиндры вместимостью 50 и 300 мл; пипетки вместимостью 1 мл; кристаллизатор; деревянные палочки с насечками; водяная баня; круглодонная колба с обратным холодильником; марля для фильтрования.

Материал.

1. Селезенка, свежая или замороженная.

2. Выделенный из селезенки дезоксирибонуклеопротеид.

3. РНК дрожжевая, свежеприготовленный 0,1%-ный раствор.

 

а. Выделение дезоксирибонуклеопротеида из ткани селезенки. Метод основан на способности дезоксирибонуклеопротеидов растворяться в солевых растворах большой ионной силы и выпадать в осадок при снижении их концентрации.

Ход определения. 2/3 г ткани селезенки тщательно растирают в ступке со стеклянным порошком, приливая постепенно небольшими порциями 35-40 мл раствора хлорида натрия. Полученный вязкий раствор фильтруют через 2 слоя марли в малый кристаллизатор.



Отмеряют цилиндром шестикратный (по отношению к фильтру) объем дистиллированной воды и медленно выливают ее в фильтрат. Образовавшиеся нити дезоксинуклеопротеида осторожно наматывают на деревянную палочку, переносят в пробирку для использования в последующей работе.

б. Качественная реакция на ДНК (реакция Дише). Метод основан на способности дезоксирибозы, входящей в ДНК дезоксирибонуклеопротеида, образовывать соединение синего цвета с дифениламином при нагревании в среде, содержащей смесь ледяной уксусной и концентрированной серной кислот. С рибозой РНК аналогичная реакция дает зеленое окрашивание.

Ход определения. К ¼ части осадка дезоксирибонуклеопротеида приливают 1 мл 0,4%-ного раствора гидроксида натрия (до растворения). Добавляют 0,5 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на кипящую водяную баню на 15-20 мин.

Аналогичную реакцию выполняют в другой пробирке с 1 мл раствора РНК. Отмечают характерное окрашивание в пробах.

в. Выявление белкового компонента дезоксирибонуклеопротеида (ДНП). Метод основан на биуретовой реакции (описана в работе 1).

Ход определения. Переносят часть полученных ранее нитей ДНП в пробирку, добавляют 0,5 мл раствора гидроксида натрия до растворения нитей и 5 капель биуретового реактива. Наблюдают за появлением окрашивания.

Г. Гидролиз дезоксирибонуклеопротеидов.

Ход определения. Оставшуюся часть осадка дезоксирибонуклеопротеидов, полученных из ткани селезенки, помещают в колбочку для гидролиза, добавляют 30-40 мл 5%-ного раствора серной кислоты.

Закрывают колбочку пробкой с обратным холодильником и осторожно кипятят содержимое на асбестовой сетке на медленном огне в течение 30-40 мин. Полученный гидролизат охлаждают и используют для определения составных компонентов ДНК в последующей работе (гидролизат хранить в холодильнике).

Оформление работы. В выводе отметить возможность выделения нуклеопротеидов с помощью солевых растворов и их идентификации с помощью реакций на нуклеиновый компонент.

Практическое значение работы. Выделение и очистку дезоксирибонуклеопротеидов из гомогенатов и ядер клеток с помощью растворов хлорида натрия разной концентрации используют в экспериментальной биохимии. Дифениламиновая проба лежит в основе методов качественного и количественного определения нуклеопротеидов и нуклеиновых кислот в биологическом материале. В клинической цитологии эти реакции применяют при нативной окраске нуклеиновых кислот, например, в мазках клеток крови.

 

 

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

 

При гидролизе нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты распадаются на составные части. Обнаружение и методы количественного определения нуклеиновых кислот и их мономеров (нуклеотидов) в биологическом материале и препаратах основаны на особенностях химической природы этих соединений.

 

Исследование химической природы нуклеиновых кислот

 

ДНК и РНК, имея сходство в строении, несколько отличаются по составным компонентам: в ДНК содержится тимин, а в РНК – урацил. Кроме того, углеводная часть в ДНК представлена дезоксирибозой, а в РНК – рибозой. Поэтому по специфическим реакциям на эти моносахариды можно выявить соответствующие нуклеиновые кислоты и нуклеотиды.

 

 

Работа 14. Качественные реакции на компоненты

Нуклеиновых кислот

 

Реактивы. Нитрат серебра, 2%-ный аммиачный раствор*; раствор аммиака, конц.; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор; молибдат аммония, раствор в азотной кислоте*; орциновый реактив*; дифениламиновый реактив*.

Оборудование. Глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 мл; штатив с пробирками; водяная баня.

Материал.

1. Гидролизат дезоксирибонуклеопротеида (см. работу 13, г).

2. Лекарственные препараты нуклеотидной природы: фосфаден (аденозинмонофосфат), 2%-ный раствор в ампулах, и аденозинтрифосфат натрия, 1%-ный раствор в ампулах.

 

OH
а. Проба на пуриновые основания. Метод основан на способности пуриновых оснований с аммиачным раствором нитрата серебра образовывать осадок серебряных солей пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенных в светло-коричневый цвет, по уравнению

       
   
 
 


OH

 

 


+ AgNO3 + NH4OH → H2N
HN2
N H
N
CH

           
 
 
   
гуанин
 
серебряная соль гуанина
Ag

 


Ход определения. В пробирку вносят 10 капель гидролизата, помещают в него кусочек лакмусовой бумаги и приливают по каплям примерно 10 капель концентрированного раствора аммиака до щелочной реакции по лакмусу. Добавляют 10 капель аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии образуется осадок с характерной окраской.

б. Дифениламиновая проба на пентозы. Принцип метода см. работу 13, б.

Ход определения. Для определения берут 5 капель гидролизата и проделывают реакцию, как описано в работе 13, б.

в. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. Принцип метода см. работу 11.

Ход определения. Берут 10 капель гидролизата и проделывают реакцию, как описано в работе 11.

г. Качественные реакции на лекарственные препараты нуклеотидной природы. Метод основан на обнаружении рибозы в препаратах нуклеотидной природы с помощью дифениламиновой реакции и пробы с орциновым реактивом. Последняя состоит в том, что фурфурол, образующийся из рибозы при нагревании в среде с соляной кислотой, дает с орцином окрашенное соединение зеленого цвета.

Ход определения. В две пробирки добавляют по 5 капель соответственно раствора фосфадена и аденозинтрифосфата натрия. К ним приливают по 10 капель дифениламинового реактива, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отмечают результат реакции.

В две другие пробирки вносят по 5 капель тех же веществ и добавляют по 5 капель орцинового реактива. Нагревают в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Отмечают результат реакции.

Оформление работы. По результатам работы сделать вывод о возможности использования реакции для обнаружения компонентов нуклеиновых кислот и нуклеотидов и их применения в практике. Данные оформить в виде таблицы.

 

Материал   Выявляемый компонент Реакция Результат реакции

 

Практическое значение работы. Реакции на компоненты нуклеиновых кислот и нуклеотиды могут применяться для их идентификации и количественного анализа в биохимических исследованиях, а в фармации – для контроля качества препаратов нуклеотидной и нуклеозидной природы.

 

 









Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:


©2015- 2019 zdamsam.ru Размещенные материалы защищены законодательством РФ.