Сдам Сам

ПОЛЕЗНОЕ


КАТЕГОРИИ







Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материале





 

В реакциях, катализируемых оксидоредуктазами, окисляемый субстрат рассматривается как донор водорода или электронов, а акцептором могут быть природные вещества (коферменты – НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, КоQ, кислород, органические соединения, цитохромы и др.) и ксенобиотики.

Для большинства ферментов этого класса рекомендуются названия: дегидрогеназы и редуктазы. В тех случаях, когда акцептором служит О2, используется термин оксидаза, а если кислород в ходе реакции включается в состав субстрата, то фермент называется оксигеназа. Пероксидаза является ферментом, использующим Н2О2 в качестве акцептора, а каталаза – ферментом, катализирующим реакции, где донорно- акцепторную пару составляют две молекулы Н2О2.

 

Реактивы. Формальдегид, 0,4%-ный раствор; метиленовый синий, 0,01%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; лабораторный термометр; пипетки вместимостью 1 и 5 мл.

Материал.

1. Картофельный сок (сырой картофель натирают на терке и отжимают через два слоя марли).

2. Свежее коровье молоко.

 

а. Выявление альдегидоксидазы (альдегид: кислород оксиредуктаза; КФ 1.2.3.1) в молоке. Метод основан на визуальном наблюдении за обесцвечиванием метиленового синего (МС), связывающего водород, который отщепляется с участием альдегидоксидазы от субстрата.

Альдегидоксидаза катализирует реакцию дегидрирования различных альдегидов, например, формальдегида. Водород переносится на ФАД+, являющийся коферментом данного фермента, а затем на конечный акцептор – кислород – по уравнению

Альдегидоксидаза

НС ═ О + Н2О + ФАД+ Н ─ С ═ О + ФАД∙Н2

│ │

Н ОН

 

Альдегидоксидаза

ФАД∙Н2 + О2 ФАД+ + Н2О2

 



При добавлении МС – искусственного акцептора водорода – в бескислородных условиях образуется его восстановленная форма (лейкоформа) МС∙Н2:

 

Альдегидоксидаза

Н ─ С ═ О + Н2О Н ─ С ═ О

│ │

Н ФАД+ ФАД∙Н2 ОН

 
 

 

 


МС∙Н2 МС

(лейкоформа) (синее окрашивание)

 

Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть, то он вновь приобретет синюю окраску:

 

МС∙Н2 + О2 → МС + Н2О2

 

Ход определения. В две пробирки вносят по 5 мл свежего молока и добавляют в первую 1 мл воды, а во вторую такой же объем раствора формальдегида. В обе пробы приливают по 1 мл раствора метиленового синего, содержимое перемешивают и приливают 3-4 капли вазелинового масла (для предохранения жидкой смеси от контакта с кислородом воздуха).

Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 37˚С. Через 5-10 мин сравнивают изменение окрашивания в пробах. Сильно встряхнув, вновь отмечают переход окраски.

б. Выявление пероксидазы (донор: Н2О2 оксидоредуктаза; КФ 1.11.1.7) в картофеле и в молоке. В основе метода лежит реакция с бензидином (см. работу 9, а).

Ход определения. В две пробирки наливают по 1 мл соответственно сырого молока и картофельного сока. Добавляют в обе пробы по 5 капель спиртового раствора бензидина и по капле раствора пероксида водорода. Отмечают характерное окрашивание.

Оформление работы. Результаты занести в таблицу и отметить характерное окрашивание индикатора реакции.

 

Материал Выявленный фермент Субстрат (донор) Акцептор Индикатор реакции Результат

 

В выводах указать на присутствие в биологическом материале изучаемых ферментов и практическое значение работы.

 

 

Работа 21. Обнаружение холинэстеразы

(ацетилхолинацилгидролаза; КФ 3.1.1.7)

в сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа

 

Реактивы. Полоски фильтровальной бумаги, смоченные субстратно-индикаторным раствором (0,2 г ацетилхолина-бромида и 0,1 г дибромсульфофталеина растворить в 7 мл 96%-ного этанола).

Оборудование. Предметные стекла; пинцеты; микропипетки; часы; водяная баня.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на изменении окраски индикатора дибромсульфофталеина (от синей до зеленой и желтой), происходящем в результате освобождения уксусной кислоты при гидролизе ацетилхолина холинэстеразой:

 

O

║ холинэстераза

(CH3)3N+―CH2―CH2―O―C―CH3 + H2O (CH3)3N+―CH2―CH2OH + CH3COOH

ацетилхолин холин уксусная

кислота

Ход определения. На чистое предметное стекло наносят каплю сыворотки крови, на нее пинцетом опускают полоску бумаги, которая тут же окрашивается в синий цвет. Засекают время. Пробу накрывают вторым предметным стеклом и отмечают время появления желтого окрашивания бумаги.

Оформление работы. Занести результаты (время появления желтого окрашивания индикаторной бумаги от момента помещения ее на каплю сыворотки крови) и сравнить их с нормой, которая колеблется от 5 до 20 мин. Сделать вывод о присутствии изучаемой гидролазы в сыворотке крови.

 

 

Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы

в сыворотке крови по методу В.И.Товарницкого и Е.Н.Волуйской

 

Реактивы. Фруктозо-1,6-бисфосфата, натриевая соль, 1%-ный раствор*; смесь на альдолазу*, раствор 2,4-динитрофенилгидразина 0,1%-ный раствор, трихлоруксусная кислота 10%-ный раствор, едкий натрий 3%-ный раствор, калибр. раствор*.

Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки на 0,2; 0,1; 1,0; 2,0; 5,0 мл; центрифуга; термостатирующая водяная баня; фотоэлектроколориметр.

Материал. Исследуемая сыворотка крови.

 


Метод основан на определении дигидроксиацетонфосфата (ДОФ), образующегося в ходе расщепления фруктозобисфосфата с участием альдолазы:

 

 
 

Дигидроксиацетонфосфат при взаимодействии с 2,4-динитрофенил­гидразином образует гидразон, который в щелочной среде имеет коричнево-бурую окраску:

 

Ход определения. В центрифужную пробирку (опытная проба) к 0,2 мл смеси на альдолазу с фруктозо-1,6-бисфосфатом (смешать 1,75 мл смеси на альдолазу с 0,25 мл фруктозо-1,6-бисфосфата) внести 0,1 мл сыворотки крови. В другую центрифужную пробирку (контрольная проба) взять 0,175 мл смеси на альдолазу без фруктозо-1,6-бисфосфата и добавить 0,1 мл сыворотки крови. Обе пробирки поместить в термостат при температуре 37˚С на 1 час. По истечении времени пробирки вынуть из термостата и добавить к контрольной пробе 0,025 мл раствора фруктозо-1,6-бисфосфата. Для осаждения белков в обе пробирки внести по 0,3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугировать 10 минут при 3000об/мин, слить центрифугат в другую пробирку и, добавив по 0,6 мл 3% раствора едкого натрия, оставить стоять на 10 минут при комнатной температуре. Затем прилить по 0,6 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и пробы поместить на 10 минут в термостат или водяную баню при температуре 37˚С, затем добавить 4,2 мл 3% раствора едкого натрия. Фотометрировать на ФЭКе при длине волны 530-540 нм (зеленый светофильтр) в кювете на 0,5 см против контрольной пробы.

 

Примечание. Так как окраска неустойчива, то фотометрировать следует сразу после добавления едкого натрия.

 

Расчет. По полученной величине экстинкции по калибровочному графику находят активность фермента в мкмоль/ч∙л.









Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:


©2015- 2019 zdamsam.ru Размещенные материалы защищены законодательством РФ.