Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений

Реактивы. Этанол, 96%-ный; бензин; гидроксид бария, насыщенный раствор; аскорбиновая кислота, кристаллическая; соляная кислота, 10%-ный раствор.

Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; капельницы; пипетки вместимостью 5 мл; аптечные весы с разновесками; ступка с пестиком.

а. Экстрагирование пигментов из листьев крапивы. Метод основан на способности хлорофилла и других пигментов под действием горячего спирта переходить в раствор, при этом хлорофилл при взаимодействии со спиртом превращается в этилхлорофиллид – сложный эфир, в котором остаток фитола замещен остатком этилового спирта.

Ход определения. 0,5 г сушеной крапивы растирают в ступке с 5,0 мл этилового спирта, переносят в пробирку и нагревают на водяной бане при 90-100˚С до закипания спирта. Содержимое фильтруют через бумажный фильтр в другую пробирку. Фильтрат, содержащий хлорофиллид, ксантофилл и другие пигменты, имеет зеленый цвет с интенсивной красной флюоресценцией. Его используют для исследования.

б. Разделение пигментов по Краусу. Метод основан на различной способности пигментов растворяться в бензине: хлорофилл, хлорофиллид растворимы, а ксантофилл нерастворим в нем.

Ход определения. К 10 каплям полученного фильтрата прибавляют равный объем бензина, содержимое тщательно встряхивают, постукивая пальцем по дну пробирки. Наблюдают за окраской пигментов, содержащихся в разных растворителях.

в. Осаждение хлорофилла. Метод основан на способности эфирных групп при омылении раствором гидроксида бария образовывать бариевые соли хлорофиллидов А и В, нерастворимых в воде; жидкость над осадком имеет желтую окраску вследствие присутствия в вытяжке каротина и ксантофилла.

Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 20 капель раствора гидроксида бария и тщательно взбалтывают. Наблюдают за происходящими изменениями.

г. Восстановление хлорофилла аскорбиновой кислотой. Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать хлорофилл, приобретающий вследствие этого желтое окрашивание.

Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 2 капли воды, несколько кристалликов аскорбиновой кислоты и в течение 3-5 мин нагревают в водяной бане при 70-80˚С. Наблюдают за изменением окраски.

д. Получение феофитина из хлорофилла. Метод основан на способности соляной кислоты связывать ион магния, входящий в состав хлорофилла, с образованием феофитина, имеющего оливково-бурый цвет.

Ход определения. К 5 каплям фильтрата прибавляют 1 каплю раствора соляной кислоты. Наблюдают за изменением окраски.

Оформление работы. Дать оценку качественным реакциям на пигменты растений. В выводах обосновать значение хлорофилла и других пигментов для фотосинтетических процессов.

Практическое значение работы. Методы разделения и анализа пигментов фотосинтетического аппарата растений используются для изучения физико-химических свойств, фотохимической активности и характеристики их состава на разных стадиях онтогенеза растений и влияния на него факторов внешней среды.

Работа 45. Определение активности пероксидазы

в растительном материале по методу А.Н.Бояркина

Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 5,4^*; пероксид водорода, 0,03%-ный раствор; бензидин, 0,92 г/л раствор на ацетатном буфере^*.

Оборудование. Колбы вместимостью 25 мл; пипетки вместимостью 5 мл; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; ФЭК.

Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бензидина под действием пероксидазы.

Ход определения. Навеску 100 мг растительного материала помещают в ступку и растирают, прибавляя порциями 10 мл дистиллированной воды. Растертую массу переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Содержимое колбы настаивают 10 мин, затем сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Для определения активности фермента берут кювету с толщиной слоя 2 см и наливают в нее по 2 мл водной вытяжки из листьев, ацетатного буфера и раствора бензидина. Ставят кювету в кюветодержатель и устанавливают стрелку прибора на нулевую отметку, затем добавляют 2 мл раствора пероксида водорода пипеткой с широким носиком (чтобы сильная струя перемешала жидкость в кювете) и одновременно с добавлением пероксида включают секундомер. Раствор в кювете начинает синеть и по мере нарастания интенсивности окраски стрелка прибора отклоняется. Отмечают время от начала приливания раствора пероксида водорода до достижения стрелкой гальванометра отметки 0,250. Повторяют определение трижды и берут среднее значение времени.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по формуле

где х – активность пероксидазы, Е∙с^-1∙кг^-1 (Е – единица экстинкции);

1000 – коэффициент пересчета граммов в килограммы;

Оформление работы. Рассчитать и сравнить активность пероксидазы в исследуемом материале; в выводе отметить биологическое значение фермента.

Практическое значение работы. Пероксидаза выполняет две функции: собственно пероксидазную, т.е. окисляет вещества с участием пероксида водорода, и оксидазную, т.е. катализирует окисление субстратов за счет молекулярного кислорода без участия пероксида водорода. Этот фермент проявляет перокисдазную активность в отношении практически всех фенолов (пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, гваякол и др.), ароматических аминов (бензидин, n-фенилендиамин и др.), аскорбиновой кислоты, нитритов и т.д.

В то же время пероксидаза, обладая оксидазной функцией, способна участвовать в окислении флороглюцина, НАД∙Н₂, НАДФ∙Н₂, индолилуксусной кислоты, оксалата, фенилпирувата и т.д.

В практике широко используют определение активности пероксидазы для оценки метаболизма ростовых веществ, лигнина и других вторичных продуктов обмена при физиологических и патологических процессах. Пероксидаза, выделенная из хрена, широко используется как аналитический реагент при проведении клинико-биохимических исследований. Поэтому метод измерения активности фермента необходим для контроля качества продажного препарата фермента.

Методы исследования обмена углеводов необходимы для диагностики сахарного диабета и других эндокринных заболеваний, энзимопатий, функции печени, почек и т.д. Одним из информативных показателей состояния углеводного обмена является уровень глюкозы в крови, исследование которого чаще всего проводится в клинике. Реже прибегают к изучению содержания других сахаров и гликогена, а также к определению концентрации молочной и пировиноградной кислот. При наследственных нарушениях метаболизма углеводов известную диагностическую ценность представляет определение активности участвующих в нем ферментов.

Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 30 г/л раствор; о-толуидиновый реактив^*; глюкоза, основной стандартный 27,8 мМ раствор, свежеприготовленный.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1, 1 и 5 мл; водяная баня; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Метод основан на способности глюкозы при нагревании с о-толуидином в растворе уксусной кислоты давать зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации глюкозы.

Ход определения. В центрифужную пробирку отмеряют 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Из пальца обследуемого берут микропипеткой 0,1 мл крови и выдувают в пробирку с трихлоруксусной кислотой. Смесь в пробирке перемешивают встряхиванием и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Отбирают 0,5 мл центрифугута в другую пробирку и добавляют в нее 2 мл о-толуидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 8 мин, после чего охлаждают под струей холодной воды.

Для постановки стандартной пробы вместо крови берут 0,1 мл разведенного в 5 раз стандартного раствора глюкозы, добавляют 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты и с 0,5 мл полученной смеси проводят реакцию с о-толуидиновым реактивом.

Фотометрируют опытную и стандартные пробы на ФЭКе при 590-650 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см в сравнении с дистиллированной водой.

Расчет. Содержание глюкозы в крови х (моль/л) рассчитывают по формуле

С_ст – концентрация глюкозы в стандартной пробе, равная 5,55 ммоль/л.

Оформление работы. Рассчитать концентрацию глюкозы в крови обследуемого и сделать вывод о причинах возможных изменений ее уровня.

Практическое значение работы. Методы, применяемые для определения глюкозы, не всегда дают истинное содержание ее в крови, поэтому существуют понятия – «истинная» глюкоза и сахар крови. Последний показатель включает всю сумму восстанавливающих углеводов и некоторые редуцирующие вещества неуглеводной природы (глутатион, креатин, мочевая кислота). Поэтому содержание сахара в крови выше, чем показатель истинной глюкозы.

Среди методов, позволяющих определить концентрацию истинной глюкозы в биологическом материале, следует отметить о-толуидиновый и глюкозооксидазный.

В норме содержание сахара в крови составляет 0,8-1,2 г/л, а глюкозы – 2,8-4,0 ммоль/л. Увеличение уровня сахара в крови (гипергликемия) наблюдается при сахарном диабете, при избытке в организме глюкокортикоидов – гормонов коры надпочечников, при стрессовых состояниях, при употреблении с пищей большого количества углеводов и т.д. Низкое содержание сахара в крови (гипогликемия) имеет место при голодании, нарушении всасывания глюкозы в тонком кишечнике (малосорбция), при избытке инсулина в организме (гиперинсулинизм) и т.д.

Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы

Реактивы. 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; натрий фосфат двузамещенный, 0,25 моль/л^*; раствор глюкозооксидазы^*; фенолфталин 0,5%; рабочий реактив^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,0; 2,0 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Метод основан на способности глюкозооксидазы при определенном оптимуме рН действия катализировать распад глюкозы с образованием перекиси водорода. Образующаяся перекись водорода в присутствии ионов меди окисляет фенолфталин до фенолфталеина, который в нейтральной области бесцветен, а в щелочной области окрашен в красный цвет.

Ход определения. 0,03 мл крови выливают в 1,5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 2 мл 0,25 моль/л фосфата натрия и 2 капли (приблизительно 0,1 мл) раствора глюкозооксидазы. Перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре на 1 час, затем добавляют 2 мл рабочего реактива и через 30 мин фотометрируют в кювете на 10 мм при длине волны 530 нм (зеленый светофильтр).

Одновременно ставят контрольную пробу, в которую берут 1 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и далее проводят как и опытную пробу.

Расчет. Расчет проводят по калибровочному графику.

Оформление работы. По экстинкции рассчитывают содержание глюкозы в крови, сравнивают ее содержание с нормой и делают вывод о возможных отклонениях.

Практическое значение работы. (См. определение содержания глюкозы в крови орто-толуидиновым методом).

Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; сульфат меди (II), 20%-ный и 4%-ный растворы; оксид кальция, порошок, навеска 0,5 г; серная кислота, конц.; n-гидроксидифенил, свежеприготовленный щелочной раствор (50 мг n-гидроксидифенила растворяют в 3 мл 3%-ного раствора гидроксида натрия).

Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; пипетки на 0,1 и 1 мл; стеклянные палочки; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Ход определения. В центрифужную пробирку отмеривают 0,5 мл дистиллированной воды и вносят в нее 0,1 мл крови, взятой микропипеткой из пальца обследуемого. Микропипетку промывают той же водой.

К содержимому пробирки добавляют 1 мл раствора уксусной кислоты и помещают ее на 10 мин в лед (для лучшего осаждения белков), после чего центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают в чистую центрифужную пробирку, добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора сульфата меди и 0,5 г порошка оксида кальция и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Появляется голубое окрашивание (если окрашивание зеленоватое, то проба дальнейшей обработке не подвергается). Смесь оставляют стоять на 30 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой. Затем ее центрифугируют 5 мин при 100 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку, приливают 1 каплю 4%-ного сульфата меди и осторожно наслаивают 3 мл концентрированной серной кислоты, погрузив при этом пробирку в лед и непрерывно помешивая содержимое стеклянной палочкой. После этого пробирку помещают в кипящую водяную баню на 5 мин и затем охлаждают ее в водяной бане до 20˚С.

К охлажденной смеси приливают 1 каплю (0,05 мл щелочного раствора n-гидроксидифенила и ставят пробирку в водяную баню при 30˚С на 30 мин, время от времени взбалтывая содержимое. В пробирке за это время развивается голубое окрашивание. Пробирку помещают на 90 с (точно!) в бурно кипящую водяную баню. За это время голубая окраска переходит в фиолетовую. Затем смесь охлаждают и фотометрируют на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1,0 см против воды.

Расчет. Содержание молочной кислоты х (ммоль/л) рассчитывают по формуле

где с – количество молочной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, ммоль;

0,1 – объем крови, взятый на исследование, мл;

1000 в числителе – коэффициент пересчета на 1 л крови;

1000 в знаменателе – коэффициент перевода микромолей в миллимоли.

Оформление работы. Рассчитать содержание молочной кислоты в крови обследуемого. В выводе указать на возможные сдвиги концентрации молочной кислоты и их причины.

Практическое значение работы. В норме содержание молочной кислоты в крови составляет 0,50-2,0 ммоль/л. Увеличение ее содержания может наблюдаться при усиленной мышечной работе, при заболеваниях, сопровождающихся развитием гипоксии (недостаточность сердечной деятельности, хронические бронхиты, анемия и т.д.).

Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 5%-ный раствор; 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ), 0,1%-ный раствор в 2 М растворе соляной кислоты; толуол; карбонат натрия, 10%-ный раствор; гидроксид натрия, 1,5 М раствор.

Оборудование. Пенициллиновые флакончики с полиэтиленовыми пробками; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; бюретка вместимостью 25 мл; пипетка с резиновой грушей; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл крови, приливают 4 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают встряхиванием и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

В пенициллиновый флакон отбирают 1 мл центрифугата, прибавляют 2 мл воды и 1 мл раствора 2,4-ДНФГ, перемешивают встряхиванием, закрывают пробкой и ставят в темное место на 20 мин.

К содержимому флакона добавляют 5 мл толуола, закрывают флакон пробкой и встряхивают 3 мин. После расслоения фаз отсасывают пипеткой с резиновой грушей нижний слой и отбрасывают его.

К оставшемуся во флаконе слою толуола приливают 4 мл раствора карбоната натрия, закрывают флакон пробкой и встряхивают 3 мин. После расслоения жидкостей отбирают из нижнего слоя 3 мл в пробирку и добавляют в нее 3 мл раствора гидроксида натрия (появляется красно-бурое окрашивание).

Через 5 мин фотометрируют пробу на ФЭКе при 415 нм (светофильтр синий) в кювете с толщиной слоя 1 см против воды.

Расчет. Содержание пировиноградной кислоты х (ммоль/л) рассчитывают по формуле

где с – количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкмоль;

1000 в числителе – коэффициент пересчета на литр крови;

1000 в знаменателе – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;

4 – объем добавленного раствора карбоната натрия, мл;

3 – объем раствора карбоната натрия, отобранного для проведения реакции, мл.

Оформление работы. По полученному значению экстинкции рассчитать содержание пировиноградной кислоты в крови и сделать вывод о причине возможных его изменений.

Практическое значение работы. В норме содержание пирувата в крови составляет 0,1-0,13 ммоль/л. Его уровень повышается при недостатке в организме тиамина (витамина В₁), а также в результате действия ингибиторов пируватоксидантного комплекса (арсенат, люизит и др.).

Для изучения состояния липидного обмена в организме используется определение содержания липидных компонентов в биологических жидкостях. Разные липиды входят в состав сложноорганизованных комплексов – липопротеидов – или адсорбируются белками, в основном альбуминами, плазмы или сыворотки крови. В крови содержатся хиломикроны, образующиеся в слизистой тонкого кишечника и поступающие в нее с лимфой, пре-β-липопротеиды (липопротеиды очень низкой плотности), β-липопротеиды (липопротеиды низкой плотности) и α-липопротеиды (липопротеиды высокой плотности). Апопротеиды трех последних классов липопротеидов синтезируются в печени, поэтому по содержанию липопротеидов в крови судят не только о липидном обмене, но и функции печени.

При исследовании обмена липидов в клинике определяют содержание липопротеидов, общих липидов, включающих сумму всех липидных веществ сыворотки или плазмы крови, а также отдельные их фракции – триацилглицерины, неэтерифицированные жирные кислоты, свободный и этерифицированный холестерин, фосфолипиды.

Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом

Реактивы. Серная кислота, конц.; фосфованилиновый реактив^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки для отмеривания сильных кислот; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 10 мл; стеклянные палочки; водяная баня; ФЭК.

Метод основан на способности продуктов распада ненасыщенных липидов образовывать с фосфованилиновым реактивом соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Ход определения. В опытную пробирку (сухую!) вносят 0,1 мл сыворотки крови и 2,9 мл концентрированной серной кислоты (осторожно! Специальными пипетками!), а в контрольную – 0,1 мл дистиллированной воды и 2,9 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин (осторожно!). Затем обе пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры. Из опытной и контрольной пробирок отбирают по 0,2 мл охлажденного содержимого в другие пробирки, в которые предварительно наливают фосфованилинового реактива по 3 мл в обе пробирки.

После тщательного перемешивания стеклянной палочкой пробы ставят на 45 мин в темное место при комнатной температуре (для развития окрашивания).

Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр), в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание общих липидов в сыворотке крови х (г/л) рассчитывают по формуле

где m – масса общих липидов в пробе, найденная по калибровочному графику (рис.6), мг;

10000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

1000 – коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;

3 – общий объем исходной смеси (0,1 мл сыворотки крови + 2,9 мл концентрированной серной кислоты), мл;

0,2 – объем смеси, взятой для проведения цветной реакции, мл.

Оформление работы. По найденному значению экстинкции рассчитать содержание общих липидов в крови, указав на возможные изменения в их содержании и причину этих изменений. В выводах отметить практическое использование метода определения общих липидов в клинической лаборатории для выявления нарушений липидного обмена.

Практическое значение работы. Нормальное содержание общих липидов в сыворотке крови (нормолипемия) составляет 4,0-8,0 г/л. При физиологических условиях увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наблюдается через 1-4 ч после принятия богатой жирами пищи. Натощак уровень общих липидов снижается (гиполипемия). Гиперлипемия проявляется при многих патологических состояниях: у больных сахарным диабетом отмечается резко выраженная гиперлипемия (до 20,0 г/л), при заболеваниях почек (липоидном нефрозе), при поражении печени (циррозе печени и остром гепатите), при ожирении, при врожденной гиперлипемии, атеросклерозе и у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: