Работа 74. Определение содержания порфобилиногена в моче

Реактивы. Реактив Эрлиха^*, насыщенный раствор натрия ацетата; хлороформ; бутиловый спирт; бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0-5,0).

Оборудование. Пипетки на 5,0 и 10 мл; штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными пробирками.

Материал. Моча (подвергается исследованию в течение 2-3-х часов после мочеиспускания).

Метод основан на взаимодействии порфобилиногена с п-диметиламинобензальдегидом с образованием соединения, окрашенного в красный цвет.

Ход определения. В пробирке смешивают 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают стеклянной палочкой. Затем измеряют рН индикаторной бумагой, значение рН должно быть в интервале 4,5-5,0, если рН меньше 4,0 добавляют раствор ацетата натрия для установления нужного рН. Если окраска не образуется – результат отрицательный. При образовании розовой или красной окраски добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний водный слой становится бесцветным или желтым – результат отрицательный. При сохранении окрашивания водной фазы переносят 6-8 мл водного слоя в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 2:1 и встряхивают. Обычно фазы разделяются быстро, в противном случае смесь центрифугируют. При переходе окраски в бутиловый слой результат отрицательный, а если водная фаза остается окрашенной – результат положительный для порфобилиногена.

Примечание. При хранении мочи свыше 3-х часов при комнатной температуре реакция может быть ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением порфобилиногена в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2-3 часа, ее хранят в холодильнике при 4˚С или в замороженном состоянии. При хранении в холодильнике и доведении рН мочи до 6,0-7,0 порфобилиноген стабилен длительное время.

Оформление работы. Отметить характер развившегося окрашивания, сделать вывод о возможности практического использования данного определения.

Практическое значение работы. В норме порфобилиноген в моче не обнаруживается (0,2 мг/л). Данным методом он выявляется при концентрации, превышающей 6 мг/л) при различных формах печеночных порфирий – острая перемежающая, копропротопорфирия, наследственная копропорфирия).

Работа 75. Количественное определение содержания

Реактивы. Уксусная кислота ледяная; хлорная кислота 57%; натрия ацетат 3-х водный; дельта-аминолевулиновая кислота гидрохлорид; уголь активированный с дисперсностью 0,25-1 мм; ацетил-ацетон; п-диметиламинобензальдегид; ацетатный буфер рН 3,6^*; взвесь угля^*; реактив Эрлиха^*; беззольные фильтры (синяя лента), калибровочный раствор^*.

Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки вместимостью 0, 1, 2,0 и 10 мл; пробирки с притертыми пробками; спектрофотометр.

Материал. Моча. Хранится в холодильнике, рН мочи должен быть равен 6,0, для чего добавляют на 10 мл мочи 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.

Метод основан на способности дельта-аминолевулиновой кислоты взаимодействовать с п-диметиламинобензальдегидом после удаления порфобилиногена и других мешающих определению веществ с помощью активированного угля. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации данной кислоты в пробе.

Ход определения. К 1 мл мочи в пробирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взвеси активированного угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию взбалтывают 1 минуту и фильтруют через бумажный фильтр. В две пробирки (контрольную и опытную) отбирают по 2 мл фильтрата. В опытную пробу добавляют 0,05 мл ацетилацетона, в контрольную – такое же количество ацетатного буфера. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем пробирки помещают на 20 минут в кипящую водяную баню, охлаждают, доводят объем жидкости ацетатным буфером до 2 мл и в каждую пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха, перемешивают. Через 15 минут спектрофотометрируют опытную пробу против контрольной при длине волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение часа.

Расчет. Содержание дельта-аминолевулиновой кислоты проводят по калибровочному графику, условия построения которого представлены в таблице.

Из каждой пробы отбирают по 2 мл раствора в две пробирки (контрольную и опытную), которые обрабатывают как указано выше. По полученным данным строят калибровочный график.

Расчет. При расчете рекомендуется проводить пересчет на 1 г креатинина, т.к. диурез за сутки может быть различным.

Содержание АЛК в моче рассчитывают по формуле с использованием калибровочного графика:

где С – количество АЛК в пробе (мкмоль), найденное по калибровочному графику;

Коэффициент пересчета микрограмм АЛК в микромоли – 0,0076.

Оформление работы. По полученным экстинкциям сделать расчет содержания дельта-аминолевулиновой кислоты и вывод о причине возможных изменений.

Практическое значение работы. В норме содержание АЛК в моче 3,9-19 мкмоль/г креатинина (0,52-2,5 мг/г креатинина). Выделение аминолевулиновой кислоты с мочой увеличивается при патологических процессах, связанных с нарушением порфиринового обмена, а также при интоксикации свинцом, бензолом и другими токсическими веществами.

Работа 76. Количественное определение содержания копропорфирина

в моче по методу Соулсби в модификации Римингтона

Реактивы. Уксусная кислота ледяная; эфир медицинский; соляная кислота 1,4 моль/л; йод, спиртовой раствор 0,039 моль/л; раствор йода в соляной кислоте (200 объемов соляной кислоты и 1 объем спиртового раствора йода).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 2,0 и 5,0; делительные воронки, спектрофотометр.

Материал. Свежевыделенная моча (срок хранения не более 3-х часов).

Метод основан на способности йода переводить копропорфириноген в копропорфирин, который определяется спектрофотометрически по разнице оптической плотности при трех длинах волн.

Ход определения. В делительную воронку вносят 2 мл мочи, 0,2 мл ледяной уксусной кислоты, 5 мл эфира и встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. К эфирному слою, содержащему копропорфирин и копропорфириноген, добавляют 5 мл раствора йода в соляной кислоте для перевода копропорфириногена в копропорфирин, встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз нижний слой переносят в пробирку, термостатируют при 37˚С, в течение 5 минут. Затем содержимое пробирки встряхивают и измеряют оптическую плотность раствора в кюветах с толщиной слоя 1 см при трех длинах волн: 380, 402 и 430 нм против 1,41 моль/л раствора соляной кислоты.

[2·E₄₀₂ – (E₄₃₀ + E₃₈₀)] ∙ 2,093·1,52 нмоль/г креатинина

КП = —————————————————————————————————————

где Е₄₀₂, Е₄₃₀, Е₃₈₀ – оптическая плотность раствора при соответствующих длинах волн;

1,52 – коэффициент пересчета микрограмм КП в наномоль;

2,093 – коэффициент для расчета содержания КП, предложенный Римингтоном.

Оформление работы. По полученным результатам сделать расчет содержания копропорфирина и сделать вывод о причине возможных изменений.

Практическое значение работы. В норме содержание копропорфирина в моче 30,5-122 нмоль/г креатинина (20-80 мкг/г креатинина). Повышение содержания копропорфириа в моче наблюдается при наследственной копропорфирии, острой перемежающейся порфирии, эритропоэтической уропорфирии, а также при циррозе, гепатите, свинцовой интоксикации.

К регуляторам метаболизма можно отнести витамины, гормоны, гормоноподобные вещества и медиаторы. Свою функцию они осуществляют посредством модификации активности ферментов или влияния на их количество в клетках. Поэтому при исследовании данной группы биологических соединений применяют как методы качественного и количественного анализа этих веществ и продуктов их обмена, так и оценку состояния системы регуляторов организма по их действию на соответствующие звенья метаболизма.

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Живите по правилу: МАЛО ЛИ ЧТО НА СВЕТЕ СУЩЕСТВУЕТ? Я неслучайно подчеркиваю, что место в голове ограничено, а информации вокруг много, и что ваше право...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: