Клонирование дрожжей (3 пассаж)

Возбудители маслянокислого брожения — строгие анаэробы, подвижные палочки с клостридиальным или плектридиальным типом спорообразования.

По преобладанию тех или иных конечных продуктов маслянокислое брожение подразделяют на истинно маслянокислое брожение (брожение глюкозы, крахмала), ацетонобутиловое брожение, брожение пектиновых веществ.

Маслянокислые бактерии широко распространены в почве (как правило, содержатся в 90% почвенных образцов), навозе, загрязненных водоемах, в разлагающихся растительных остатках, молоке, на поверхности растений и т. д.

Процесс маслянокислого брожения протекает по схеме:

4С₆Н₁₂О₆= ЗСН₃СН₂СH₂СООН + 2СН₃СООН + 8СО₂+ 8Н₂

Кроме масляной, в процессе брожения в заметных количествах образуется уксусная кислота, а при подкислении среды (до рН 5,5) — значительные количества бутилового спирта и ацетона.

Энергетическим материалом для маслянокислых бактерий служит крахмал, водорастворимые углеводы (декстрины, ди-, моносахариды), органические кислоты (молочная, пировиноградная) и спирты (маннит, глицерин). В качестве источника азота бактерии используют самые различные азотистые соединения: пептон, аминокислоты, аммиачные соли, а некоторые — даже атмосферным азот.

Характерная особенность маслянокислых бактерий — способность накапливать в клетках гранулезу перед образованием спор.

МПБ, глюкоза, картофель, мел, колбы Вюрца. винтовые зажимы, каучуковые пробки и трубки, водоструйный насос или масляный насос Камовского, пробирки, пипетки, водяная баня, раствор Люголя (I + KI), 5%-ный раствор FеCI_3,предметные и покровные стекла, микроскопы.

Для изучения маслянокислого брожения можно воспользоваться средой МПБ с добавлением 3—5% глюкозы. Чтобы в этой среде развивались преимущественно маслянокислые бактерии, следует создать, в нем строго анаэробные условия и после заражения почвой нагреть до кипения. При нагревании споры маслянокислых бактерий остаются жизнеспособными, а неспорообразуюшие бактерии погибают.

В колбу Вюрца объемом 250—500 мл наливают 30—50 мл питательной среды, вносят примерно 0,5 г почвы и ¼ чайной ложки мела для нейтрализации, образующейся в процессе брожения масляной кислоты. На асбестовой сетке колбу нагревают до кипения, не закрывая пробкой. Сняв с огня, колбу охлаждают под струей водопроводной воды, закрывают сверху каучуковой пробкой, а на боковой тубус надевают каучуковую трубку с винтовым зажимом. Присоединив колбу через каучуковую трубку к насосу (водоструйному или, лучше, масляному насосу Камовского), открывают винтовой зажим и выкачивают из колбы воздух до появления в среде пузырьков. Затем каучуковую трубку зажимают винтовым зажимом и колбу ставят в термостат при 30—35 °C.

Маслянокислое брожение крахмала также исследуют на среде с картофелем. Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими ¹/₃ высокой пробирки, добавляют немного мела, заливают водопроводной водой на ²/₃ и помещают на водяную баню при 80 ºС на 10 мин для пастеризации. В среду не вносят ни почвы, ни маслянокислых бактерий, так как на кожуре картофеля всегда есть их споры.

Через 2—3 дня картофель всплывает вследствие бурно идущего газообразования. По окончании брожения культуральную жидкость используют для исследования морфологии маслянокислых бактерий и качественного определения продуктов брожения.

Микроскопирование маслянокислых бактерий. Питательную среду из колбы Вюрца или пробирки с картофелем берут пипеткой, закрыв указательным пальцем верхний конец и погрузив ее кончик в средний слой сброженной жидкости. Слегка приподняв палец, набирают в пипетку жидкость, снова зажимают пальцем верхний конец пипетки и, вынув ее из колбы, наносят каплю на предметное стекло. К накопительной культуре добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом, на которое наносят каплю кедрового масла.

При микроскопировании препарата обнаруживаются клетки Clostridium (от лат. close — закрыть, clostrum — замок, tridium — надолго, долгоживущие, поскольку имеют спору в жизненном цикле) butyricum (от греч. butyrum — масло), С. butylicum, С. pasteurianum (см. рис. 4, ж) и других бактерий, имеющих подобную форму. В клетках можно заметить овальные тельца, сильно преломляющие свет. Это споры. В тех местах клетки, где содержится гранулеза, возникает сине-фиолетовое окрашивание. Зарисовывают только окрашенные клетки, явно относящиеся к группе маслянокислых бактерий. Особенно хороший материал для наблюдений получается при постановке опыта на картофеле.

Качественные реакции на масляную кислоту. Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl₃). Нейтральные растворы маслянокислых солей при нагревании с FeCI₃, приобретают коричневое окрашивание вследствие образования маслянокислого железа.

В пробирку наливают 3—5 мл сброженной жидкости, добавляют 1—2 мл 5%-ного хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению:

ЗСа(СН₃СН₂СН₂СОО)₂ + 2FeCl₃ =2Fe(CH₃CH₂CH₂COO)₃ + 3CaCl₂

Раствор маслянокислого железа в отраженном свете имеет буровато-коричневый цвет, а в проходящем свете — кроваво-красный.

Получение масляноэтилового эфира (ананасовой эссенции). К 3—5 мл культуральной жидкости впробирке прибавляют 0,5 мл 96%-ного этилового спирта и 1-2 мл концентрированной серной кислоты. При взбалтывании и нагревании появляется характерный запах эфира (запах ананаса).

Са(СН₃СН₂СН₂СОО)₂+ 2СН₃СН₂ОН = СН₃СН₂СН₂СООСН₂СН₃+ Са(ОН)₂

Лимонная кислота широко применяется в производствах: в кондитерском, безалкогольном, различных экстрактов и в ряде не пищевых отраслей (полиграфии, кожевенной промышленности, в медицине и т.д.).

Раньше единственным способом получения лимонной кислоты являлась её экстракция из различного растительного сырья: цитрусовых плодов, махорочный лист, листья и отходы переработки хлопчатника, плодов дикорастущих гранатов и др. Однако все эти производства были вытеснены более эффективным микробиологическим методом: ферментативное производство лимонной кислоты из мелассы даёт более дешёвый конечный продукт, в десять раз по сравнению с махорочным листом и впять раз по сравнению с сырье из хлопчатника и дикорастущим гранатом.

Возможность получения лимонной кислоты путём культивирования микробиологических грибов на сахарных питательных средах открыта немецким ботаником К. Вемером в 1893 году и с 20-х годов текущего века её технология начала интенсивно разрабатываться. В настоящее время во многих развитых странах эффективно работают современные предприятия по производству лимонной кислоты глубинным способом.

Производство лимонной кислоты химическим синтезом возможно, но экономически не целесообразно, т.к. эта технология многостадийна, требует применения дорогого сырья и сильно токсичных реагентов (циановодорода, хлора и др.) и даёт относительно низкий выход целевого продукта. Преимущество микробного способа заключается в последовательном ферментативном осуществлении в клетке большого числа химических реакций в одну производственную стадию – ферментацию. Это упрощает технологию, увеличивает выход кислот и снижает их себестоимость.

В качестве сырья для ферментативного получения лимонной кислоты в большинстве стран используют мелассу – побочный продукт производства сахара из сахарной свеклы или сахарного тростника. Однако теоретически можно использовать растворы уксусной кислоты, ацетатов, метилового и этилового спирта, н-парафины и т.д.

Лимонная кислота принадлежит к классу ациклических аминокислот, т.е. соединений, содержащих одновременно спиртовый гидроксил и карбоксильную группу. Её формула: СООН

(окситрикарбаллиловая кислота), т.е. это трёхосновная многоатомная оксикислота.

Наиболее широко распространённый м.о. – продуцент лимонной кислоты – специальный мутантный штамм микроскопического плесневелого гриба Aspergillus niger. Известны два способа ферментации: глубинный и поверхностный. По первому из них мицелий гриба погружён в питательную среду в ферментёрах, по второму – мицелий располагается на поверхности среды в открытых кюветах, размещённых на многоярусных стеллажах в специальных растильных камерах. Так как грибы рода Aspergillus являются строгими (облигатными) аэробами, то в ферментёры и растильные камеры непрерывно подают стерильный воздух. При дыхании гриба и образовании кислоты выделяется тепло, которое отводят из ферментёров пропусканием холодной воды через теплообменник, а из камер – продуванием воздуха, поддерживая температуру питательной среды 30 – 32 ^оС.

Принципиальная технологическая схема производства лимонной кислоты.

питательные соли подготовка питательной среды щёлочь

горячая вода отделение и промывка цитрата кальция фильтрат

горячая вода отделение и промывка гипсовый шлам

пар первое выпаривание раствора лимонной кислоты

активированный осветление раствора отработанный

уголь лимонной кислоты и фильтрование уголь

холодная отделение и промывка кристаллов маточный

Ознакомиться с биохимическими и микробиологическими основами получения лимонной кислоты биотехнологическим методом, изучить технологию процесса, освоить методики анализа.

Исходную культуру As.niger высеивают на 6 пробирок с сусло-агаром – это первый квартальный период. Пробирка № 1 используется для пересева снова на 6 пробирок второго квартального пересева; № 2 – остаётся в музее; № 3 – используется для пересева на 6 пробирок, предназначенных для трёх стадий производственного размножения спорового посевного материала; № 4 – используется в случае повторного пересева при трёхстадийном размножении спор; № 5 и № 6 – расходуются для микробиологического и биохимического контроля квартального пересева рабочего штамма.

Необходимость замены старой культуры вызывается накоплением в рабочей культуре малоактивных форм и снижением активности биосинтеза лимонной кислоты.

Первая стадия размножения посевного материала (стадия А) осуществляется на скошенном сусло-агаре. Любая из шести пробирок, полученных из пробирки № 3 квартального пересева, является исходной для получения посевного материала. Из неё производят посев на 12 пробирок скошенного сусло-агара, которые инкубируют трое суток в термостате при 32 ^оС, затем хранят при комнатной температуре.

Из этих 12 пробирок рабочего пересева пробирка № 1 может быть использована для очередного пересева также на 12 пробирок; № 2 сохраняется в музее; № 3 – идёт на засев конических колб стадии Б; № 11 и № 12 поступают на биохимический анализ. После пересева из всех пробирок берётся взвесь для микробиологического контроля, для чего производят посев на поверхность среды в чашки Петри.

Вторая стадия размножения посевного материала (стадия Б).

Готовят жидкую питательную среду (Журавского-Терентьевой): на 1 кг 3-5% солодового сусла (готовится разбавлением стандартного сусла) добавляют 2 г NH₄Cl; 0,25 г KH₂PO₄; 0,25 г MgSO₄^.7H₂O; 0,0125 г FeSO₄^.7H₂O. Среду разливают в конические стеклянные колбы ёмкостью 1 – 3 л слоем 1 см и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. В течение 30 минут.

Пробирочные культуры стадии А (пробирки 3 – 10) в возрасте 12 – 16 суток используют для засева питательной среды в конических колбах. Из каждой пробирки стадии А засевают две трёх литровые колбы с площадью дна 2 см² каждая. После засева колбы в течение 3 – 4 суток выдерживают в термостате при температуре 32 ^оС, затем хранят 4 – 6 суток при комнатной температуре (или 6 – 11 суток в холодильнике при температуре 5 ^оС). Выращенные в конических колбах спороносные плёнки (стадия Б) через 7 – 15 суток после посева для следующей стадии В. В стерильных условиях плёнки переносят пинцетом в плоские кюветы и высушивают в сушильном шкафу. Затем сухие конидии собирают специальным приспособлением типа пылесоса. С двух плёнок мицелия штамма 82 собирают около 1 г конидий.

Третья стадия (В). На стадии В применяют среду Журавского (солодовое сусло плотностью 7% 10 г/л NaCl + 1 г/л мочевины), разлитую по 1000 мл в специальные плоские ёмкости, а затем простерилизованную в автоклаве при 1 атм. В течение 4 – 5 суток высеивают в термостате при температуре 32 ^оС, а затем до употребления хранят при температуре не выше 10 – 12 ^оС.

10 – 15 суток спороносные плёнки стадии В используют для заготовки сухих спор. Для этого грибки плёнки высушивают при температуре 36 – 38 ^оС в течение 4 – 5 часов и собирают споры в закрытую ёмкость (бюкс).

II. а. Для поверхностного культивирования применяют конические колбы ёмкостью 0,5 л с площадью дна 0,8 дм², куда наливают по 160 мл питательной среды состава, г/л: сахароза – 75; NH₄NO₃ – 3 (или NH₄Cl – 4); КН₂РО₄ – 0,5; MgSO₄^. 7H₂O – 0,5; ZnSO₄ ^.7H₂O – 0,05; FeSO₄ ^. 7H₂O – 0,25. Питательную среду после стерилизации засевают споровой взвесью, содержащей 300 – 350 тыс. конидий в 1 мл через 42 – 44 часа роста при температуре 31 ^оС питательный раствор под выросшей плёнкой заменяют таким же количеством бродильного (производственного) раствора состава, г/л: 200 г сахарозы + 1,91 г NH₄Cl. Через 4 суток из-под плёнки сливают и в нём определяют титрованием количество кислот. Под плёнку наливают 100 мл воды, кипятят, плёнку отжимают и в отжиме также определяют количество кислоты, которое суммируют с количеством кислоты в сброженном растворе. Обычно плёнка гриба As.niger штамма 82 площадью 0,8 дм² за четверо суток синтезирует 18 – 22 г кислоты.

II. б. Для глубинного культивирования используют лабораторные ферментёры с мешалкой.

В стерильный ферментёр заливают стерильную питательную среду состава, г/л: сахароза – 125; NH₄NO₃ - 2,5; КН₂РО₄ – 0,16; MgSO₄^. 7H₂O – 0,25.

После засева питательной среды споровой взвесью (150 – 200 тыс. конидий в 1 мл среды) культивирование ведут в течение 6 суток при температуре 32 ^оС на одной и той же питательной среде при непрерывном перемешивании и аэрировании стерильным воздухом (около 1,0 л/л ^. м). По окончанию процесса замеряют объём сброженной массы, раствор кипятят и фильтруют.

В сброженном растворе и мицелии определяют общую титруемую кислотность, состав кислот и остаточный сахар, обычно штамм 82 в глубинных условиях продуцирует за 6 суток 60 – 70 г лимонной кислоты на 1 л исходного раствора.

Выделение лимонной кислоты производят согласно привычной технологической схеме. В КЖ после отделения мицелия содержится смесь лимонной, глюконовой и щавелевой кислот, остатки сахаров и минеральные примеси. Выделение лимонной кислоты из КЖ основано на её свойствах, образовывать малорастворимую соль – трёхкальциевый цитрат. Нейтрализацию ведут при температуре около 100 ^оС в колбе с мешалкой и известковым молоком до рН 6,8 – 7,5. При этом цитрат и оксалат кальция выпадают в осадок, а глюконат кальция отделяют от раствора и тщательно промывают горячей водой. Смесь цитрата оксалата кальция загружают в колбу с мешалкой, заливают водой, добавляют активированный уголь, нагревают смесь до 60 ^оС, подают расчётное количество серной кислоты (по уравнению).

Смесь кипятят 10 – 20 мин. Оксалат кальция в этих условиях не разлагается. Отфильтрованный раствор лимонной кислоты на упаривание при плотности 1,24 – 1,26 г/см³ из раствора выпадает осадок гипса, его отфильтровывают и продолжают упаривание до плотности 1,35 – 1,36 г/см³, что соответствует 80% концентрации лимонной кислоты. Из упаренного раствора в кристаллизаторе после внесения затравки (кристаллов лимонной кислоты) при перемешивании и постепенном охлаждении до 8 – 10 ^оС ведут кристаллизацию. Образовавшиеся кристаллы отделяют, промывают небольшим количеством холодной воды и сушат. Товарный продукт должен содержать не менее 99,5% лимонной кислоты (в пересчёте на моногидрат).

Основные возбудители спиртового брожения – дрожжи играют большую роль в жизни человека. Дрожжи традиционно используют в хлебопечении, для получения спирта и многих других продуктов.

Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы, которые в зависимости от наличия и типа полового процесса относят к 3-м классам грибов: Ascomycetes, Basidomycetes и Deutermycetes. К классу Ascomycetes относятся дрожжи, образующие при половом размножении сумки с эндогенными спорами. Класс Basidomycetes включает дрожжи, формирующие телиоспоры и базидоподобные спорофоры с экзогенными половыми спорами (споридиями). К Deutermycetes или несовершенным грибам, относят дрожжи, у которых не обнаружен половой цикл.

В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах. Они растут на поверхности сладких плодов, в некоторых цветках, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Также содержаться в пищеварительном тракте человека и животных.

ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: