Таразский государственный университет им. М.Х. Дулати

для выполнения практических работ по дисциплине

для студентов специальности 5В070100 - Биотехнология

Методические указания для выполнения _______________________________________

/практических, лабораторных работ, РГЗ, ДЗ, КП/КР/

по дисциплине ___________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

для студентов специальности_______________________________________________________

________________________________________________________________________________

_________________________________________ разработаны в соответствии с типовой учебной программой дисциплины.

Методические указания разработаны: ____________________________________________

________________________________________________________________________________

Методические указания обсуждены на заседании кафедры

________________________________________________________________________________

1-практическая работа. Бродильные производства, основанные на жизнедеятельности бактерий………………………………………………………………………………………………

2- практическая работа. Приготовление питательных сред для культивирования микроорганизмов………………………………………………………………………………………..........

3- практическая работа. Методы микроскопического исследования микроорганизмов, приготовление живых препаратов микроорганизмов для микроскопирования………………..

4- практическая работа. Микроскопирование клеток дрожжей ………………………………..

5- практическая работа. Клонирование дрожжей (1 пассаж)…………………………………..

6- практическая работа. Клонирование дрожжей (2 пассаж)………………………………….

7- практическая работа. Клонирование дрожжей (3 пассаж)…………………………………...

8- практическая работа. Итоговая работа по клонированию дрожжей……………………….

9- практическая работа. Получение спирта……………………………………………………..

10- практическая работа. Приготовление кисломолочного продукта «Наринэ» (первичная закваска). Кисломолочное брожение………………………………………………………………

11-практическая работа. Приготовление кисломолочного продукта «Наринэ»………………

12-практическая работа. Технология приготовления плавленных сыров……………………..

13-практическая работа. Органолептическая оценка качества и определение подъемной силы прессованных дрожжей……………………………………………………………………….

Правила по технике безопасности при работе в микробиологической лаборатории

ü Не входить в лабораторию в пальто, головном уборе, не вносить посторонние вещи.

ü Приступать к занятиям только надев хлопчатобумажный халат.

ü Строго соблюдать правила обращения с химическими реактивами и красителями.

ü С большой осторожностью пользоваться смесью спирта с эфиром, не переносить се на столы с горелками.

ü Поскольку некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами, не допускать их распыления — не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.

ü Перед тем как набирать ртом с помощью пипетки суспензии микроорганизмов или реактивы, убедиться в том, что пипетка закрыта с тупого конца ватой.

ü В лаборатории поддерживать порядок и чистоту. По окончании занятий протирать иммерсионный объектив микроскопа мягкой тканью, накрывать микроскоп полиэтиленовым чехлом, приводить в порядок рабочее место, мыть руки.

ü Помнить о том, что студенты несут ответственность за используемые ими микроскопы, другое лабораторное оборудование, чистоту рабочего места.

ü Перед уходом из лаборатории дежурному проверять, выключены ли газ, вода, электроприборы.

Приготовление питательных сред для культивирования

Одной из основных задач микробиологии является выявление численности микроорганизмов (КОЕ — колониеобразуюших единиц) в том или ином субстрате. Однако универсальной среды, на которой бы выявлялись все существующие в данном субстрате микроорганизмы, нет. Немецкий ученый Р. Кох предложил относительно универсальную среду на основе мясного бульона, на которой хорошо развиваются микроорганизмы, использующие органические азотсодержащие соединения.

Позднее С. И. Виноградским в практику микробиологии были введены элективные, или избирательные, среды, предназначенные для определенных групп микроорганизмов. Они составлены в расчете на предельно строгие условия, при которых должен развиваться только избранный микроорганизм и никакой другой. Основной принцип элективных сред — учет избирательных потребностей микроорганизма в специфических условиях развития. Зная физиологические особенности соответствующей группы микроорганизмов, можно подобрать не только химический состав среды, но и такие условия культивирования (активную кислотность среды, условия аэрации, температуру и др.), при которых создается лабораторная имитации экологической ниши естественных условий обитания. Элективные среды позволяют осуществлять биологические процессы в лаборатории и на производстве без предварительной стерилизации среды. Примером элективных сред могут служить среды для выделения азотфиксаторов, нитрификаторов. Эти среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их природного обитания и получения их накопительных культур.

Накопительные среды были предложены голландским ученым М. Бейеринком. В них интересующий исследователя компонент среды дается в избытке, чтобы выяснить, какой микроорганизм или группа микроорганизмов его используют, поскольку именно он или они будут доминировать в этой среде.

Оптимальные среды предложил А. А. Имшенецкий для целлюлозоразрушающих микроорганизмов, В. С. Буткевич — для продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger. Основной принцип оптимальных сред заключается в создании наиболее благоприятных условий для избранных микроорганизмов внесением в среду различных стимулирующих рост добавок (витаминов, ростовых веществ, микроэлементов).

По составу среды подразделяются на две группы: естественные (натуральные) и синтетические.

Естественными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав. Это — различные части растений, животные ткани, солод, дрожжи, навоз, почва, вода морей, озер и инеральных источников. Их используют чаще в виде экстрактов или настоев. На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в них есть все компоненты, необходимые для роста. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а также выяснить, какие вещества образуют микроорганизмы. Указанные недостатки связаны с тем, что состав естественных сред очень сложен и непостоянен, так как существенно колеблется в зависимости от вида сырья и способа приготовления. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

Синтетические — это такие среды, в состав которых входят в точно указанных концентрациях только известные химически чистые соединения. Синтетические среды бывают простыми и достаточно сложными по составу. Их широко используют для исследовании, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

Существуют и так называемые полусинтетические среды, относящиеся к средам с неопределенным составом. В них наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Например, в мясной бульон наряду со сложными и неопределенными по химическому составу веществами (мясной бульон) могут входить пептон, глюкоза или сахароза, поваренная соль, фосфат калия; картофельные среды содержат глюкозу и пептон. Полусинтетические среды широко используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Питательные среды могут быть различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие.

Плотные питательные среды используют для учета количества бактерий, выделения чистой культуры и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5—2,5% агара или 10—15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносят 0,1-0,2% агара.

Агар — это растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды, а также ничтожное количество азотистых веществ. Выпускают агар в виде пластин, стебельков, порошка. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата, и поэтому агар удобен как инертный уплотнитель среды. Температура плавления агара — 100 ⁰С, затвердевания — 40 ⁰С.

Желатина — кислый азотсодержащий продукт, добываемый при выварке костей, хрящей, сухожилий, чешуи рыб. Температура плавления желатины (22—25 °С) ниже температуры инкубации большинства микроорганизмов (30—37 °С). Эта особенность и способность многих микроорганизмов разжижать желатину, выделяя протсолитические ферменты, ограничивают се применение в качестве уплотняющею средства.

Плотными питательными средами служат также гелевые пластины, введенные в микробиологическую практику С. Н. Виноградским.

Для выращивания микроорганизмов, усваивающих органические формы азота, часто употребляют мясо-пептонные среды: мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар и мясо-пептонную желатину.

Приготовить следующие питательные среды: мясную воду, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, дрожжевой автолизат, твердую и жидкую среды Сабуро, пивное сусло-агар, среду Чапека.

Мясная вода. Мясо освобождают от костей, жира, пленок и сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двух- или четырехкратным количеством водопроводной воды (по весу) и кипятят в течение часа. Жидкость фильтруют через вату или полотно, затем через фильтровальную бумагу; фильтрат измеряют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой.

Разливают по 3-5-литровым бутылям и стерилизуют при 120° С в течение 30-40 минут.

Мясо-пептонный бульон (МТ1Б). К мясной воде добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистой поваренной соли и 10% воды (на выкипание). Кипятят до растворения пептона, затем в еще горячем бульоне устанавливают (насыщенным раствором едкого натра) рН 7,3-7,5. После добавления щелочи бульон еще раз кипятят в течение 15-20 минут и фильтруют через бумажный фильтр. Бульон разливают по пробиркам (колбам) и стерилизуют при 120° С в течение 15-20 минут (после стерилизации рН, как правило, дает сдвиг на 0,2-0,3 в сторону кислой реакции.

Мясо-пептонный агар (МПА). На I л мясной воды берут 10 г пептона и 5 г поваренной соли, варят в течение 30 минут, устанавливают рН, фильтруют, добавляют 30 г лучших сортов архангельского агара (одесского нужно брать 60 г), нагревают до полного растворения и проверяют реакцию. Фильтруют через вату или марлю (в теплом автоклаве), а затем прозрачную среду разливают по колбам и стерилизуют при 120° С в течение 15-20 минут.

Дрожжевой автолизат используют для приготовления основного питательного субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствующих их самоперевариванию. Дрожжевые среды обеспечивают пышный рост, несмотря на низкое содержание общего азота и слабую степень его расщепления.

Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы автолизат занимал около 1/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей на 20-литровую бутыль). Бутыль с дрожжами ставят на 2 суток в термостат при температуре около 60° С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равномерного прогревания содержимого (1-2 раза в сутки). Конец автолиза характеризуется полным расжижением дрожжей. Автолизат должен иметь коричневый оттенок и приятный запах.

Качество автолизата ухудшается, если процесс протекает при температуре ниже 58° С. По окончании автолиза в бутыль добавляют тройное (по исходной массе дрожжей) количество теплой водопроводной воды (на 4 кг дрожжей 16 л воды). Разведенный автолизат помещают в автоклав для стерилизации при 1-1,3 атм (120-123° С) на 30 мин. Оставляют на несколько дней (не меньше 5-7 дней) для отстаивания.

Твердая среда Сабуро (для дрожжей и грибов). Основой этой среды является дрожжевая вода. На 1 л водопроводной воды берут 80 г прессованных пекарских дрожжей (или 20 г сухих дрожжей), кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, нагревают до растворения агара, затем добавляют 4% глюкозы (или мальтозы), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Среду можно готовить и не на дрожжах, а на 1 %-ной пептонной воде. После стерилизации среду в пробирках скашивают.

Жидкая среда Сабуро отличается от описанной выше тем, что не содержит агара. Среду разливают в колбы по 150-200 мл, стерилизуют также, как описано выше. Эта среда употребляется главным образом для получения гемокультуры.

Пивное сусло-агар (для дрожжей и грибов). Неохмеленное пивное сусло разводят водопроводной водой до содержания сахара 7-8% по Баллингу (измеряют сахарометром) и стерилизуют при 110° С 10 мин. В таком виде сусло может сохранятся длительное время. Перед употреблением надосадочную жидкость осторожно сливают с осадка. В 1 л стерильного сусла добавляют 18 г агара, нагревают до растворения агара и разливают по колбам. Стерилизуют при 110° С 10 мин. Жидкое сусло после сливания отстоявшейся жидкости с осадка разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при режиме, указанном для сусло-агара.

NаNОз - 2; КС1 - 0,5; КН₂РО₄ - 1; Fе₂(SО₄)_{3 *}7Н₂О - 0,01; Мg5О₄_*7Н₂О -0,5; рН 5,2. Стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 20 мин. После стерилизации в колбы над пламенем горелки добавляют источник углерода.

1. На какие группы можно разделить питательные среды, дайте их характеристику?

2. Роль агара и желатины в приготовлении питательных сред?

3. Основные соли, макро и микроэлементы, используемые при приготовлении питательных сред.

4. Нетрадиционные виды сырья, используемые при приготовлении питательных сред.

Тема: Методы микроскопического исследования микроорганизмов, приготовление живых препаратов микроорганизмов для микроскопирования

Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы. В группу дрожжей объединяются грибы, которые существуют преимущественно в виде отдельных клеток. Клетки разных видов дрожжей морфологически довольно разнообразны: круглые, яйцевидные, лимоновидные, овальные. Длина их составляет 2-20 мкм, а ширина 1,5-10 мкм. Размножаются дрожжи вегетативно и половым путем. Клетки дрожжей грамположительны. На плотных питательных средах дрожжи растут в виде врастающих в субстрат колоний, имеющих мягкую консистенцию и разнообразных по форме: выпуклых, круглых, лопастных. Колонии могут быть бесцветными или окрашенными в желтый, оранжевый, розовый цвета.

В зависимости от наличия и типа полового процесса дрожжи относят к трем классам грибов: Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. Термин «дрожжи» в строгом смысле не имеет таксономического значения.

К классу Ascomycetes относят дрожжи, образующие при половом размножении сумки (аски) с эндогенными спорами. К нему принадлежат представители родов дрожжей, используемых в бродильных производствах, Saccharomyces и Shizosaccharomyces.

Класс Basidiomycetes включает дрожжи, формирующие телиоспоры (телейтоспоры) и базидиоподобные спорофоры с экзогенными половыми спорами (споридиями).

К Deuteromycetes, или несовершенным грибам, относят дрожжи, у которых не обнаружен половой цикл. Считают, что организмы, принадлежащие к этой группе, произошли от высших грибов в результате утраты ими половых функций.

В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к обитанию в различных местах, содержащих чаще всего углеводы.

Они растут на поверхности сладких плодов, в нектаре цветков, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Встречаются дрожжи и в водоемах. Содержатся они в пищеварительном тракте человека и животных. Большинство дрожжей сапрофиты, но среди видов, находящихся и во внутренних органах и на кожных покровах человека, имеютсяпатогенные, или условно патогенные, формы, например, возбудитель кандидомикозов - Candida albicans. Некоторые дрожжи вызывают болезни растений.

Многие дрожжи осуществляют спиртовое брожение и используются для производства пива, вина, хлеба, спирта. Биомасса кормовых дрожжей рода Саndida используется в качестве питательных добавок к рационам сельскохозяйственных животных.

В пробирку помещаем 0,5 г сухих дрожжей, туда же заливаем
5 мл стерильной дистиллированной воды, оставляем на 1 час при комнатной температуре (или 5 г прессованных дрожжей заливаем 5 мл стерильной дистиллированной воды), затем подкисляем концентрированной серной кислотой до рН = 2,0 и выдерживаем 10 минут; после этого доводим рН до 4,0, добавив несколько капель раствора NаОН. Центрифугируем суспензию дрожжей при 2000 об/мин в течение 10 минут. Взвешиваем осадок, который представляет собой оживленные дрожжи.

1. Промышленная микробиология / под. ред. Н.С. Егорова. - М.: Высшая школа, 1989. – 503 с.

2. Березовский, В.М. Химия витаминов / В.М. Березовский. - М.: Наука, 1973. – 489 с.

3. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильников, Г.И. Переверзева. - М.: Колос, 1993. – 321 с.

4. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 608 с.

5. Драк, А.И. Получение эргостерина без коагуляции дрожжевой массы / А.И. Драк, Г.И. Аксенович, В.В. Высоцкий, Я.С. Мелляр // Химико-фармацевтический журнал. – 1989. - № 6. – С. 41-43.

6. Бабьева, И.П. Биология дрожжей / И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. – 221 с.

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: