Репродукция вирусов, особенности ее обеспечения в лабораторных условиях. Методы культивирования вирусов.

Репродукция вирусов осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга: адсорбция вируса на клетке; проникновение вируса в клетку; «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; формирование вирионов; выход вирионов из клетки.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны — так называемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.

Проникновение в клетку. Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга. «Раздевание». Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной процесс проникновения вируса в клетку сочетается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.

Биосинтез компонентов вируса. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства. Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с процессами транскрипции, трансляции и репликации.

Формирование (сборка) вирионов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически «узнавать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, солевых и водородных связей. Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру: 1) Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм; 2) Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа); 3) Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки; 4) Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).

Выход вирионов из клетки. Различают два основных типа выхода вирусного потомства из клетки. Первый тип — взрывной — характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип — почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции. Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5—6 ч (вирусы гриппа, натуральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы и др.). Ретровирусы (ВИЧ, онкогенные вирусы) имеют уникальный путь передачи генетич. инф-ии. Геном ретровирусов состоит из двух идентичных мол. РНК, т.е. он является диплоидным. В составе ретровируса есть особый вирусоспецифич. фермент – обратная транскриптаза (ревертаза), с помощью кот. осуществляется процесс обратной транскрипции, т.е на матрице геномной РНК синтезируется комплементарная однонитевая ДНК. Эта нить копируется с образованием двунитевой комплиментарной ДНК, кот. интегрирует в кл. геном и в его составе транскрибируется в иРНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

Схема синтеза белков: геномная РНК вируса --- комплементраная ДНК -------- транскрипция иРНК -----трансляция белка вируса. Репликация вирусного генома (синтез вирусных нукл. к-т) приводит к накоплению в кл-ке копий исходных вирусных геномов, кот. используются при сборке вирионов. Обратная транскриптаза ретровирусов синтзирует мину-нить ДНК, с которой копируется плюс-нить ДНК, с образованием двойной нити ДНК, замкнутой в кольцо. Далее двойная нить ДНК интегрирует с хромосомой клетки, образуя провирус. Многочисленные вирионные РНК обр-ся в результате транскрипции одной из нитей интегрированной ДНК при участии клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

Культивирование вирусов производится в 3-х биологич. моделях: в организме лаб. животных, в развивающихся эмбрионах птиц (куриные эмбрионы), культурах кл. Выращенные вирусы определяют с помощью методов индикации (обнаружение факта их репродукции, основанная на выявлении различных биол. св-в вирусов и особенностей их взаимод.) и идентификации (определение вида, типа, осущ-ся с помощбю иммунологич. реакций, основанных на взаимод. АГ вирусов с соответствующими АТ). О репродукции вирусов в орг-ме животных судят по развитию у них видимых клинич. проявлений заболев. и на основании реакции гемагглютинации с суспензией изи органов, содержащих вирусы. О репродукции вируса в эмбрионе свидетельствуют специф. поражения оболочек и тела эмбриона, гибель эмбриона, положит. РГА с вируссодержащей жидкостью. Этот метод используют при промышленном выращивании вирусов. Культуры клеток в зависимости от техники приготовления различают однослойные (способны прикрепляться и размножаться на поверхности хим. нейтрального стекла лаб. посуды в виде монослоя), суспензионные (кл-ки размнож. во всем объеме пит. среды при пост. ее перемешивании), органные (цельные кусочки органов и тк., сохранившие исходную структуру). По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на: первичные (выдерживают не более 5-10 пассажей), перевиваемые (способны размнож. в лаб. условиях неопределенно длит. срок), полуперевиваемые (выдерждивают 40-50 пассажей).

3. От двух человек выделена культура стафилококка. Один из них болел пиодермией, второй – здоров. От чего это зависит, от каких качеств микроба? Как доказать, что выделенный штамм стафилококка причастен к развитию болезни? Как определить возможный источник?

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 29

1. Патогенные спирохеты, сифилис.

Сифилис — хроническое венерическое заболевание, характеризующееся последовательной сменой отдельных периодов болезни. Возбудитель сифилиса был. открыт в 1905 г. немецким ученым Шаудином.

Морфология и биологические свойства. Treponema pallidum представляет собой тонкую извитую нить размером 15x0,25—0,5 мкм, имеющую 8—14 равномерных витков спирали, расположенных близко друг к другу. С трудом окрашивается анилиновыми красками и поэтому получила название бледной спирохеты. Для окраски используют метод Романовского — Гимзы (спирохеты окрашиваются в бледно-розовый цвет), негативное окрашивание раствором туши (спирохеты остаются неокрашенными и видны на темном фоне). Для выявления спирохет в инфицированных тканях используют метод импрегнации серебром (метод Левадити), при котором трепонемы, окрашенные в черный цвет, видны на фоне желтых клеток ткани. При исследовании материала в темном поле зрения бледная спирохета отличается от сапрофитных спирохет, встречающихся на слизистых оболочках полости рта и половых органов, равномерными завитками, плавными волнообразными движениями. Она тоньше других трепонем, способна сгибаться под углом и совершать характерные маятникообразные движения. Культивируется возбудитель сифилиса с трудом, в анаэробных условиях. Для выращивания используют среды, содержащие кроличью или лошадиную сыворотку (среды Уленгута и Терских). При этом культуральные (полученные на питательных средах) штаммы спирохет теряют вирулентность и изменяют антигенную структуру. Трепонемы содержат эндотоксин, имеют сложное антигенное строение.

Устойчивость. Бледная спирохета вне тканей больного быстро погибает, неустойчива при высушивании, действии обычных дезинфицирующих веществ и высокой температуры; даже при 40°С погибает через 2 ч. К низким температурам более устойчива: выдерживает замораживание до года.

Патогенность. В естественных условиях животные сифилисом не болеют. Экспериментально удается заразить обезьян, кроликов, хомяков.
Патогенез и клиника. Входными воротами инфекции являются слизистые оболочки и кожа, имеющие самые незначительные повреждения. Инкубационный период продолжается в среднем 3—4 нед, после чего наступает первичный период сифилиса: на месте внедрения возбудителя появляется небольшая эрозия, приподнятая над кожей, с ровными краями, гладким блестящим дном, розового или красного цвета, часто безболезненная, с плотным инфильтратом у основания, из-за которого она и получила название «твердый шанкр». Возникают недомогание, головная боль. Лимфатические узлы увеличиваются, становятся плотными без видимых признаков воспаления. Они, как правило, не спаяны с окружающими тканями. Через 20—30 дней твердый шанкр заживает.
Спирохеты из лимфатических узлов проникают в кровь, размножаются и заносятся в органы и ткани и могут вызвать их поражения. Через 6—7 нед от начала заболевания развивается вторичный период сифилиса, характеризующийся генерализацией процесса и появлением обильных и разнообразных высыпаний на коже и
слизистых оболочках (сифилиды) розовых или красных тонов, Сифилиды могут возникать в виде розеол, папул, везикул, пустул. Если лечение не проводится, то через 2— 3 года наступает третий период сифилиса — гуммозный. Возникает бугорковый сифилид, или глубокий узловой сифилид (подкожная гумма). На коже и слизистых оболочках появляются плотные шаровидные бугорки. Они могут существовать неопределенно долгое время, а затем рассасываются или изъязвляются с последующим образованием рубца. При образовании сифилитической гуммы в подкожной жировой клетчатке появляется узел, который увеличивается, спаивается с окружающей клетчаткой и с кожей. Над центральной частью гуммы кожа истончается и она вскрывается. Гумма превращается в гуммозную язву с неприятным запахом: дно ее покрыто некротическим распадом. В течение нескольких месяцев язва заживает и на ее месте остается втянутый звездчатый рубец. В последнем, четвертом, парасифилитическом периоде, который может наступить через 10—20 лет после начала заболевания, наблюдаются специфические поражения центральной нервной системы в форме прогрессивного паралича или спинной сухотки.
Иммунитет. Естественный, врожденный, иммунитет отсутствует: заражение всегда приводит к развитию заболевания. Вопрос о состоянии приобретенного иммунитета до конца не изучен. Во время болезни вырабатывается нестерильный иммунитет, носящий характер клеточного, тканевого. Его называют противошанкерным, так как при повторном заражении во время болезни новый шанкр не появляется, а спирохеты распространяются по всему организму, принимая участие в развитии последующих сифилитических поражений.
Микробиологическая диагностика. Основные методы лабораторной диагностики — микроскопический и серологический. В первый период проводят микроскопию серозного содержимого твердого шанкра в темном поле или в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимзе. Микроскопическому исследованию подвергают также отделяемое кожных поражений вторичного и третичного периодов. Начиная с 5—6-й недели от момента заражения или на 2—3-й неделе после появления твердого шанкра используют серологические методы диагностики. Применяют РСК (реакцию Вассермана) и осадочные реакции (реакции преципитации) Кана и Закса — Витебского. Реакцию Вассермана ставят с сывороткой больного, используя неспецифические антигены (спиртовой экстракт липоидов из бычьего сердца с добавлением холестерина, или кардиолипиновый антиген), так как оказалось, что глобулины сыворотки больного сифилисом способны соединяться липоидными вытяжками, полученными из различных органов. Наряду с неспедифическими используют специфический антиген, полученный из ткани яичка кролика, зараженного бледной трепонемой. При отсутствии гемолиза реакцию считают положительной, так как очевидно, что комплемент связался со специфической системой антиген — антитело. Осадочные реакции просты по технике постановки. Суть их заключается в том, что при добавлении к сыворотке больного концентрированного липоидного антигена появляются помутнение, а затем и осадок. Ввиду того что антигены в этих реакциях неспецифичны, они могут быть положительны и при других инфекционных заболеваниях (туберкулез, малярия и др.).
РИФ — реакция непрямой иммунофлюоресценции — является специфической при диагностике сифилиса. В ка­честве антигена используют взвесь тканевых трепонем. Используется реакция РИФ_200. Сыворотку больного инактивируют так же, как для реакции Вассермана, и разводят в соотношении 1:200. На предметные стекла наносят капли антигена, высуши­вают и фиксируют 5 мин в ацетоне. Затем на препарат наносят сыворотку больного, через 30 мин промывают и высушивают. Следующим этапом является обработка препарата флюоресци­рующей сывороткой против глобулинов человека. Изучают пре­парат с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая степень свечения трепонем.

РИТ—реакция иммобилизации трепонем — также является специфической. Живую культуру тре­понем получают при культивировании в яичке кролика. Яичко измельчают в специальной среде, в которой трепонемы со­храняют подвижность. Ставят реакцию следующим образом: взвесь тканевых (подвижных) трепонем соединяют в пробирке с исследуемой сывороткой и добавляют свежий комплемент. В одну контрольную пробирку вместо исследуемой сыворотки добавляют сыворотку здорового человека, в другую — вместо свежего комплемента добавляют инактивированный — неактив­ный. После выдерживания при 35 °С в анаэробных условиях (анаэростат) из всех пробирок готовят препарат «раздавленная» капля и в темном поле определяют количество подвижных и не­подвижных трепонем.

Единственным источником инфекции является человек во все периоды болезни. Путь передачи — непосредственный контакт с больным (чаще всего при половом сношении), реже—через предметы обихода. Возможна передача инфекции новорожденному через плаценту от больной матери.

Профилактика. Неспецифическая - привлечение к обследованию и лечению лиц, являющихся источником заражения, и контактировавших с ними, массовые профилактические осмотры, диспансерные методы работы. Существенную роль в профилактике играют раннее выявление источников инфекции, своевременное лечение, ликвидация беспорядочных половых связей. Специфическая профилактика не проводится.

Лечение. Новарсенол, препараты висмута, ртути, пенициллин.

ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: