Процессинг мРНК: Альтернативный сплайсинг, аутосплайсинг.

Процессинг (или созревание РНК) это процесс превращения только что синтезированной, не активной РНК (про-иРНК) в функционально активную РНК. Процесс связан со структурными и химическими модификациями про-иРНК. Происходит в ядре до момента выхода РНК в цитоплазму. Состоит из нескольких этапов: присоединение про-иРНК к белку, метилирование некоторых оснований, маркировка одного из концов, полиаденилирование другого (противоположного) конца, вырезания интронов и сшивание экзонов. Последние два процесса носят название сплайсинг. Это совокупность процессов обеспечивающих превращение синтезированной РНК (РНК-транскрипта) в функционально активные РНК (зрелые РНК), которые могут быть использованы при синтезе белков. Сами РНК-транскрипты функционально не активные. Процесс характерен для эукариот. В результате процессинга изменяется структура и химическая организация РНК. РНК-транскрипт до образования зрелой РНК носит название про-иРНК(или в зависимости от вида РНК – про-тРНК, про-рРНК), т.е. предшественница РНК. Практически все РНК-транскрипты эукариот и прокариот (за исключением иРНК прокариот) подвергаются процессингу. Превращение РНК-транскрипта в зрелую РНК начинается в ядре, когда синтез РНК ещё не закончен и она не отделилась от ДНК. В зависимости от механизмов различают несколько этапов созревания РНК.

1. Взаимодействие про-иРНК с белком.

2. Метилирование про-иРНК.

3. Кэпирование 5’-конца.

4. Полиаденилирование.

5. Сплайсинг.

Сплайсинг. В РНК-транскрипте содержится определённое количество нуклеотидных последовательностей, которые были необходимы для успешного завершения трансляции и последующей модификации транскрипта (кэпирования, полиаденилирования и т.д.). Для выполнения основной роли РНК в цитоплазме – трансляции, эти последовательности не только не будут иметь функционального значения, но могут помешать нормальному течению синтеза белка. Поэтому в клетке предусмотрен механизм освобождения первичного транскрипта от целого ряда последовательностей, не имеющих решающего значения в трансляции. К таким последовательностям прежде всего относят интроны. Ген, с которого транскрибировалась про-иРНК содержит кодирующие и некодирующие последовательности. Кодирующие последовательности гена определяют аминокислоту и их последовательность в белке. Не кодирующие последовательности таким свойством не обладают. Кодирующие и некодирующие последовательности в гене чередуются, и их количество зависит от индивидуальных генов. В первичном транскрипте также содержатся кодирующие и некодирующие последовательности. Такая организация генов и про-РНК характерна для эукариот.

17. Транскрипция эукариотической РНК-полимеразами I и III: какие виды РНК синтезируются и участвуют белковые факторы тринскрипции. Транскрипция — это процесс синтеза молекулы РНК на участке ДНК, используемом в качестве матрицы. Смысл транскрипции заключается в переносе генетической информации с ДНК на РНК. Молекула ДНК состоит из двух комплиментарных друг другу цепей, а РНК — только из одной. При транскрипции матрицей для синтеза РНК служит только одна из цепей ДНК. Ее называют смысловой цепью. Исключением является митохондриальная ДНК, в которой обе цепи являются смысловыми и содержат разные гены. Также как исключение на ядерной ДНК некоторые гены могут быть локализованы на несмысловой цепи.При транскрипции молекула РНК синтезируется в направлении от 5' к 3' концу (что естественно для синтеза всех нуклеиновых кислот), при этом по цепи ДНК синтез идет в обратном направлении: 3'→5'.

У эукариот каждый ген транскрибируется отдельно. Исключение опять же представляет митохондриальная ДНК, которая транскибируется на общий мультигенный транскрипт, который затем разрезается. Так как у прокариот гены образуют группы, формируя один оперон, то такие гены транскрибируются вместе. В любом случае транскриптоном называют участок ДНК, состоящий из промотора, транскрибируемого участка и терминатора. В транскрипции выделяют 3 стадии: инициация, элонгация, терминация. Рнк-полимеразы эукариот: РНК-полимераза I транскрибирует гены класса I: это гены 28S рРНК, 18S рРНК и 5,8S рРНК (т.е. все типы рРНК, кроме 5S рРНК). РНК-полимераза II транскрибирует гены класса II: это гены, кодирующие белки (т.е. продуктом РНК-полимеразы II является мРНК). Кроме того, РНК-полимераза II синтезирует малые ядерные РНК (мяРНК) (U1-U5). РНК-полимераза III транскрибирует гены класса III, т.е. осуществляет синтез тРНК, 5S рРНК, U6 (это одна из мяРНК). РНК-полимераза IV транскрибирует все виды РНК митохондрий, по строению сходна с прокариотической. В состав РНК-полимераз эукариот входит большое количество субъединиц, они значительно крупнее прокариотических. РНК-полимеразы эукариот состоят из двух больших субъединиц и 10-15 малых. Две большие субъединицы сходны у разных типов РНК-полимераз эукариот и аналогичны субъединицам РНК-полимераз прокариот.

18. Основные транскрипционные факторы и инициация транскрипции РНК-полимеразой II (образование комплекса инициации). Инициация – первый этап транскрипции, в ходе которого происходит связывание РНК-полимеразы с промотором и образование первой межнуклеотидной связи. У бактерий холофермент РНК-полимераза непосредственно узнает определенные последовательности нуклеотидных пар в составе промотора: последовательность 5-ТАТААТ-3 (расположена на расстоянии 10 нуклеотидов от точки начала транскрипции и называется боксом Прибнова) и последовательность 5-ТТГАЦА-3 (удалена от точки начала транскрипции на 35 нуклеотидов). В некоторых оперонах, например в лактозном, необходимо предварительное взаимодействие с промотором дополнительного белка РНК-полимеразы эукариот не способны самостоятельно связываться с промоторами транскрибируемых генов. В присоединении к транскриптонам РНК-полимераз принимают участие общие факторы транскрипции (TF). Они отличаются от σ-факторов прокариот тем, что могут связываться с ДНК независимо от РНК-полимеразы. Полимеразы I, II и III требуют присутствия разных факторов транскрипции, обозначаемых TF I, TF II и TF III соответственно. Промоторы эукариот устроены более сложно, чем прокариотические, и состоят из нескольких элементов. Из низ самым близким к точке начала транскрипции является ТАТА-домен, называемый также доменом Хогнесса. Затем следуют домены ЦААТ и ГЦ. Промоторы эукариот могут содержать различные комбинации этих элементов, но ни один из них не встречается во всех промоторах. Домен ЦААТ играет существенную роль в инициации транскрипции, ТАТА и ГЦ, по-видимому, выполняют вспомогательные функции. Связавшись с промотором, РНК-полимераза вызывает локальную денатурацию ДНК, т. е. разделение цепей ДНК на протяжении примерно 15 нуклеотидных пар. Образуется транскрипционный «глазок». Первым в строящуюся цепь РНК включается пуриновый нуклеотид – АТФ или ГТФ, при этом все три его фосфатных остатка сохраняются. После образования первой фосфодиэфирной связи σ-фактор у бактерий теряет связь с ферментом, и оставшийся core -фермент начинает перемещаться по ДНК. РНК-полимераза эукариот после инициации транскрипции также теряет связь с транскрипционными факторами и перемещается по ДНК самостоятельно.

19. Описать процесс терминации транскрипции: какие последовательности расположены в зоне терминатора: что способствует разрушению контакта между транскрибируемой цепью ДНК и молекулой РНК. Транскри́пция (от лат. transcriptio — переписывание) — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК. Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. РНК-полимераза движется по молекуле ДНК в направлении 3' → 5'^[1]. Транскрипция состоит из стадий инициации, элонгации и терминации. Единицей транскрипции является транскриптон, фрагмент молекулы ДНК, состоящий из промотора, транскрибируемой части и терминатора. Обнаружены два типа сигналов терминации: ρ-зависимый и ρ-независимый терминаторы (ρ ‒ это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий АТР до АDP и неорганического фосфата). В одной из моделей действие ρ-белка объясняется тем, что он связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в направлении 5ʹ→ 3ʹ к месту синтеза РНК, необходимая для перемещения энергия выделяется при гидролизе АТР. ρ-независимые терминаторы состоят из последовательностей, представляющих собой инвертированный повтор – палиндром (рис. 31), и располагаются за 16-20 нуклеотидных пар от точки терминации. Палиндромы (последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево) ρ- независимых терминаторов содержат большое количество Г-Ц-повторов. За этим участком на матричной цепи расположена олиго (А) - последовательность (4-8 адениловых нуклеотидов подряд). Транскрипция в области палиндрома приводит к тому, что в получившемся РНК-транскрипте быстро образуется устойчивый элемент вторичной структуры – «шпилька» – спирализованная область, содержащая комплементарные Г-Ц-пары. «Шпилька» нарушает прочность связи ДНК-РНК в открытом комплексе. Кроме этого транскрипция олиго(А)-последовательности в матричной цепи ведет к образованию участка ДНК-РНК-гибрида, составленного из непрочных А-У пар, что также способствует разрушению контакта между ДНК и РНК. ρ-зависимые терминаторы. Одним из факторов транскрипции прокариот является белок ρ. ρ -фактор – это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. Он способен связываться с 5-концом синтезируемой РНК длиной около 50 нуклеотидов. ρ -фактор движется по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК. Вследствие того что в терминаторе много Г-Ц-пар (с тремя водородными связями), РНК-полимераза в области терминатора замедляет ход, ρ -фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента, и синтез РНК прекращается. На терминаторах обоих типов происходят три ключевых события: -станавливается синтез РНК; - цепь РНК освобождается от ДНК;-РНК-полимераза освобождается от ДНК. Регуляция терминации транскрипции. Существуют белковые факторы, одни из которых препятствуют, а другие способствуют терминации. В случае p-зависимой терминации регуляция синтеза белка возможна через воздействие на активность ρ-белка. Для прокариот известно два типа терминации транскрипции: ρ-зависимая и ρ - независимая. Главным фактором терминации транскрипции у бактерий является белок ρ, или ρ-фактор, или Rho-фактор, состоящий из шести субъединиц. До последнего времени считалось, что ρ-фактор, присоединившись к 5’- концу РНК, начинает двигаться по ней с той же скоростью, с какой РНК- полимераза движется по ДНК. В районе p-зависимого терминатора, отличающегося большим содержанием Г-Ц-пар азотистых оснований, РНК- полимераза притормаживает, так как ей трудно разрывать по три водородные связи в парах “гуанин - цитозин”. Поэтому р-белок, скорость которого осталась прежней, догоняет РНК-полимеразу и взаимодействует с ней, изменяя ее конформацию. В результате РНК-полимераза отделяется от ДНК. Согласно данной модели, ρ-фактор первоначально связан только со строящейся РНК, но не с РНК-полимеразой. Лишь позднее он взаимодействует с этим ферментом. По современным представлениям, ρ-фактор сразу связывается с РНК- полимеразой на старте транскрипции, еще до возникновения какого-либо фрагмента РНК. Как только строящаяся РНК становится достаточно длинной, ρ-фактор “продевает” ее сквозь себя, при этом образуя из нее петлю, и начинает тормозить движение РНК-транскрипта с использованием энергии АТФ. Из-за образования петли нарастает пространственное напряжение, которое в районе ρ-зависимого терминатора приводит к изменению конформации ρ-фактора. Это, в свою очередь, изменяет конформацию РНК-полимеразы и инактивирует ее. В итоге элонгационный комплекс останавливается в зоне терминатора, а затем медленно распадается на составные элементы. Антитерминация транскрипции - это подавление активности некоторых терминаторов. Например, у бактериофага X есть специальные белки-антитерминаторы N и Q. Белок N связывается с определенной структурой на строящейся мРНК и обеспечивает присоединение к ней четырех белков: S10, NusA, NusB, NusG. Образуется РНК-белковый комплекс, взаимодействующий с РНК-полимеразой и мешающей ей завершить трансляцию на ρ -зависимых и некоторых ρ -независимых терминаторах. Белок Q подавляет активность терминатора, связываясь не с РНК, а с ДНК. Аттенюация - это регулируемая терминация, которая происходит лишь в том случае, если строящаяся мРНК приобретает определенную вторичную структуру. Смысл этого способа регуляции - остановить синтез ферментов А, В и С, закодированных в trp-опероне, если в клетке достаточно триптофана (на примере триптофанового оперона).

20. Эукариотический геном: мобильные элементы геномаЮ мазаизм эукариотических генов. Экзоны и интроны, роль интронов. Для клеток эукариот характерно наличие оформленного ядра. Информационной макромолекулой их генома является ДНК, ко­торая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. Однако генетиче­скую информацию в клетках содержат не только хромосомы ядра. Жизненно важная генетическая информация заключена и во внехромосомных молекулах ДНК. У эукариот — это ДНК хлоропластов, митохондрий и других пластид. Под геномом эукариотического организма в настоящее время понимают суммарную ДНК гаплоидного набора хромосом и каждого из внехромосомных ге­нетических элементов, содержащуюся в отдельной клетке заро­дышевой линии многоклеточного организма. Геном эукариот существенно отличается от генома прокариот по ряду признаков, среди которых необходимо отметить его избы­точность. Эукариотическая клетка содержит во много раз больше генов, чем прокариотическая. Повышенное содержание ДНК в геноме эукариот нельзя объяснить лишь увеличением потребно­сти этих организмов в дополнительной генетической информа­ции в связи с усложнением организации, поскольку большая часть их геномной ДНК, как правило, представлена некодирующими пос­ледовательностями нуклеотидов. Феномен значительной избыточ­ности генома эукариот в отношении некодирующих последова­тельностей нуклеотидов известен под названием «парадокса С». ариотический ген можно рассматривать как совокуп­ность сегментов ДНК, которые вместе составляют экспрессируемую единицу, ответственную за образование специфического функ­ционального продукта — либо молекулы РНК, либо полипептида. К сегментам ДНК, составляющим ген, относятся следующие элементы: Единица транскрипции – это участок ДНК, кодирующий
первичный транскрипт. Он включает: а) последовательность, ко­торая обнаруживается в зрелых функциональных молекулах РНК; б) интроны (для мРНК); в) промежуточные последовательно­сти - спейсеры (для рРНК). Интроны и спейсеры удаляются в
ходе процессинга первичных транскриптов; г) 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности (5'-НТП и З'-НТП). Минимальные последовательности, необходимые для начала
транскрипции (промотор) и конца транскрипции (терминатор). Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции, ответственные за индуцибельность и репрессию транскрипции, а также клеточную, тканевую и временную спе­цифичность транскрипции. Они разнообразны по строению, по­ложению и функциям. К их числу относятся энхансеры
и сайленсеры - это последовательности ДНК, расположенные в
тысячах пар нуклеотидов от промотора эукариотического гена и
оказывающие дистанционное влияние на его транскрипцию. В отличие от прокариотических генов, почти всегда коллинеарных своим РНК, многие гены эукариот имеют мозаичное стро­ение. Под мозаичностью в данном случае подразумевается чередо­вание кодирующих (экзоны) и некодирующих (вставочные после­довательности, или интроны) последовательностей в пределах единицы транскрипции. Интроны чаще всего встречаются в генах, кодирующих белки.

Мозаичное строение чаше всего встречается в генах, кодирующих белки (с этих генов транскрибируется иРНК) и тРНК. Интересно, что сходные гены у разных организмов одного вида часто имеют одинаковое число интронов в одних и тех же позициях. Обычно длина интронов превышает длину экзонов.

Существенную часть генома эукариот (10 — 30%) составляют повторяющиеся последовательности, имеющие определенную структурную организацию и способные перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. Они получили название подвижных генетических элементов.

21. Регуляторная часть гена. Промоторы и регуляторы. Энхансерные части гена. Инсуляторы.

Регуляторные области – э то участки ДНК на которых осаждаются белки-регуляторы. Их функция – регуляция транскрипции. Для простоты эти зоны подразделяют на два типа. а. Зоны располагающиеся близко от гена, который они контролируют - контролирующие зоны.б. Зоны располагающиеся далеко от контролируемого гена - модуляторы. Промотор — в генетике это последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала специфической, или осмысленной, транскрипции. У прокариот промотор включает ряд мотивов, важных для узнавания его РНК-полимеразой, в частности так называемые последовательности -10 и -35. Промотор асимметричен, что позволяет РНК-полимеразе начать транскрипцию в правильном направлении и указывает на то, какая из двух цепей ДНК будет служить матрицей для синтеза РНК.Промоторный участок в пределах оперона может частично перекрываться или вовсе не перекрываться с операторным участком цистрона (гена).То, под каким промотором находится кодирующий РНК участок ДНК, играет решающее значение в интенсивности экспрессии этого гена в каждом конкретном типе клеток. Активация промотора определяется присутствием в каждом типе клеток своего набора транскрипционных факторов. Энхансер (англ. enhancer — усилитель, увеличитель) — небольшой участок ДНК, который после связывания с ним факторов транскрипции стимулирует транскрипцию с основных промоторов гена или группы генов. Энхансеры не обязательно находятся в непосредственной близости от генов, активность которых они регулируют, и даже не обязательно располагаются с ними на одной хромосоме. Энхансеры могут располагаться как в 5'-, так и в 3'-положении относительно матричной цепи регулируемого гена и в любой ориентации к ней. Энхансеры также могут находиться внутри интронов. Тем не менее для работы энхансера необходим его физический контакт с промотором, который осуществляется за счёт «выпетливания» ДНК между энхансером и промотором^[1]. Молекулярный механизм действия энхансера заключается в том, что он благодаря собранному на нём белковому комплексу привлекает РНК-полимеразу II и кофакторы транскрипции в область промотора.Энхансеры были впервые обнаружены в эукариотических системах^[2][3], но впоследствии сходные примеры регуляции транскрипции были открыты и у прокариот^[4].Энхансерные участки хроматина обладают следующими свойствами^[5]:способны стимулировать транскрипцию генов-мишеней;их активность не зависит от расстояния в геноме до регулируемого гена;содержат особые последовательности нуклеотидов, обеспечивающие связывание факторов транскрипции;являются местами связывания большого количества коактиваторов транскрипции и гистонацетилтрансфераз;высокочувствительны к действию дезоксирибонуклеазы I, так как содержат декомпактизированный хроматин;содержат ацетилированные гистоны.Исходя из этих свойств, с помощью высокопроизводительных методов в геноме человека было обнаружено около миллиона потенциальных энхансеров.

22. Структурная часть гена: интроны и экзоны, транспозоны.

Экзоны и интроны. Большинство генов эукариот имеет прерывистое строение, они содержат кодирующие последовательности – ЭКЗОНЫ, и некодирующие последовательности - ИНТРОНЫ. Гены начинаются и заканчиваются экзонами, набор интронов может быть любой. Например, глобиновые гены, имеют 3 экзона и 2 интрона. Другие гены могут иметь большое количество интронов (20 и более). Например, ген, кодирующий синтез белка-рецептора для липопротеинов низкой плотности (LDL), имеет 40 интронов, а ген белка дистрофина – 79 интронов. Размеры интронов больше, чем размеры экзонов, поэтому экзоны составляют очень небольшую часть. В зрелой молекуле мРНК присутствуют только экзоны, а интроны вырезаются из первичного транскрипта (пре-РНК) в процессе сплайсинга. Поэтому размеры зрелых мРНК эукариот всегда меньше размеров самого гена и пре- РНК. Не все гены эукариот содержат интроны. Не содержат интронов гены гистоновых белков, гены интерферонов, гены митохондрий млекопитающих и человека. ВЫВОДЫ: Экзоны – это кодирующие последовательности ДНК генов эукариот, представленные в зрелой молекуле РНК. Интроны – это некодирующие участки генов эукариот, которые транскрибируются, но затем вырезаются из первичного транскрипта во время сплайсинга и не входят в состав зрелых РНК, т.е. не транслируются. Существует четыре группы интронов: Ядерные интроны; Интроны группы I; Интроны группы II;Интроны группы III. Иногда интроны группы III также относят к группе II, потому что они похожи по структуре и функции. Ядерные, или сплайсосомные интроны подвергаются сплайсингу при помощи сплайсосомы и малых ядерных РНК (snRNA). В последовательности РНК, содержащей ядерные интроны, есть специальные сигнальные последовательности, которые узнаются сплайсосомой. Интроны I, II и III группы способны к автосплайсингу и встречаются реже, чем сплайсосомные интроны. Интроны II и III группы похожи друг на друга и обладают консервативной вторичной структурой. Они обладают свойствами, похожими на свойства сплайсосомы и, вероятно, являются её эволюционными предшественниками. Интроны I группы, которые встречаются у бактерий, животных и простейших — единственный класс интронов, который требует присутствие несвязанного гуанилового нуклеотида. Их вторичная структура отличается от вторичной структуры интронов II и III группы. Транспозоны (англ. transposable element, transposon) — это участки ДНК организмов, способные к передвижению (транспозиции) и размножению в пределах генома^[1]. Транспозоны также известны под названием «прыгающие гены» и являются примерами мобильных генетических элементов. Транспозоны формально относятся к так называемой некодирующей части генома — той, которая в последовательности пар оснований ДНК не несёт информацию об аминокислотных последовательностях белков, хотя некоторые классы мобильных элементов содержат в своей последовательности информацию о ферментах, транскрибируются и катализируют передвижения; например, ДНК-транспозоны и ДДП-1 кодируют белки транспозаза, БОРС1 и БОРС2. Мобильные генетические элементы относятся к повторяющимся элементам генома — тем, которые имеют несколько копий в последовательности ДНК клетки. Повторяющиеся элементы генома могут располагаться в тандеме (микросателлиты, теломеры и т. д.) и могут быть рассеяны по геному (мобильные элементы, псевдогены и т. д.)^[12]. Мобильные генетические элементы по типу транспозиции можно разделить на два класса: ДНК-транспозоны, которые применяют метод «вырезать и вставить», и ретротранспозоны, передвижение которых имеет в своем алгоритме синтез РНК из ДНК с последующим обратным синтезом ДНК из молекулы РНК, то есть метод «копировать и вставить». Транспозоны также можно разделить по степени автономности. Как ДНК-транспозоны, так и ретротранспозоны имеют автономные и неавтономные элементы. Неавтономные элементы для транспозиции нуждаются в ферментах, которые кодируются автономными элементами, которые часто содержат значительно изменённые участки транспозонов и дополнительные последовательности. Количество неавтономных транспозонов в геноме может значительно превышать количество автономных.

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: