ЛЕКЦИИ 5-6. МОДЕЛИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАШИН

Расщепление пептидной и сложноэфирной связи

Как сказано в эпиграфе любое химическое превращение определяется прежде всего разрывом определенных химических связей. Молекулярные ножницы разрезают химические связи весьма эффективно и при том «в нужном месте и в нужное время».

Реакция разрыва химической связи в молекуле А — В (не обязательно двухатомной) на части А и В может происходить в жидкой среде, когда молекула сталкивается с молекулами растворителя. Но этот процесс является маловероятным. Сначала поясним это на примерах разрыва пептидной связи (ПС) в белковой молекуле и сложноэфирной связи в молекуле нейромедиатора ацетилхолина (АХ), находящихся в воде при комнатной температуре. Затем рассмотрим, как эффективно “режут” эти связи молекулы-ножницы (гидролитические ферменты).

В процессе пищеварения ПС должны быть разорваны и белковые цепочки расщеплены до аминокислот, которые и попадают в кровь и доставляются с кровотоком ко всем клеткам организма. “Разрезание” сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина с образованием холина и ацетата непрерывно должно происходить в межклеточном пространстве нейронов для поддержания нормального функционирования нервной системы.

Мы выбрали эти типичные и вместе с тем замечательные ферменты потому, что их строение (геометрия) в кристаллическом состоянии хорошо известны. Достаточно хорошо изучены также и химические превращения в фермент-субстратном комплексе (ФСК) внутри активного центра (АЦ) этих ферментов.

Реакция разрыва пептидной связи может происходить в водном растворе белка. Однако, это очень медленный процесс. Он осуществляется по следующей схеме:

Здесь R¹, R² — остатки двух соседних аминокислот фрагмента пептидной цепи, ПС между которыми (показана волнистой чертой) подлежит разрыву. Более подробно эта реакция записывается следующим образом:

Здесь ПК означает промежуточный комплекс. Такой ПК образуется с участием ионов гидроксила

, которые всегда присутствуют в воде и роль которых сводится к “разрыхлению” двойной связи атомов С и О. Иными словами, ион

должен подойти к субстрату и временно адсорбироваться в “нужном месте”. Заметим, что описание этого процесса является особой задачей молекулярной динамики.

Реакция гидролиза АХ с образованием холина (ХОН) и ацетата происходит по подобной схеме:

Заметим, что АХ и продукты его гидролиза Х

и Аявляются ионами.

Пользуясь выражением для скорости разрыва связи (или образования продукта Р), напишем общую формулу:

Здесь Е — энергия разрываемой связи, [Р] и [OH^-] — концентрации продукта и гидроксила. Фактор 1/n, называемый “энтропийным”, является вероятностью того, что атака и сорбция [OH^-] произошла “в нужном месте”. Фактор k_бT/h определяет среднее число тепловых флуктуаций на разрываемой связи, а m₀ зависит от времени сорбции [OH^-].

Тогда “абсолютная скорость” запишется в виде:

Здесь F=E-TDS — свободная энергия разрыва связи.

Сделаем некоторые оценки. Пусть T=300 K, kT=0,6 ккал = 0,025 эВ = =4 10^-13 эрг. Тогда k_б T/h=4 10¹³ Гц. Если положить m₀ ~1, то из (1.19) и (1.20) видно, что основной вклад в скорости процессов вносят экспоненциальные множители. Напомним, что для химической связи Е ~100 k_б T!

Рассмотрим следующую таблицу, показывающую, как зависит K_абс от величины F:

Что бывает, если вместо [OH^-] в качестве катализатора выступает фермент? Его роль сводится прежде всего: 1) к изменению энтропийного фактора 1 /n=exp (T D S/k_бT); 2) понижению энергетического барьера D Е. При этом для разрыва связи кроме энергии тепловых флуктуаций и энергии сорбции не требуется какого-либо другого источника энергии.

Иногда говорят, что большая и сложная молекула фермента представляет собой “структурированный растворитель” для субстрата, который может образовать с молекулой субстрата фермент-субстратный комплекс. Вспоминая слова эпиграфа, можно сказать, что молекула А — В попадает в специально организованное силовое поле и фиксируется в нем. При этом параметры потенциального рельефа все время флуктуируют. Отдельные заряженные колеблющиеся атомы или группы атомов АЦ фермента играют роль гидроксильной группы, которая работает в водном растворе. Потенциальный рельеф в кармане АЦ организован специальным образом: в образовавшемся ФСК величины Е (и D F) снижаются. Атаки разрываемой связи заряженными группами происходят не беспорядочно, как в воде со стороны ОН^-, а по фиксированным направлениям.

Ниже приводиться разбор физических основ последовательных этапов работы молекулярных ножниц на примере АХТ.

Рис. 1.2. а): «Ленточная» схема молекулы a-химотрипсина

(светлые и темные ленты соответствуют b-структурам различных субглобул);

Для иллюстрации возможных приложений рассмотренных выше задач мы выбрали проблему взаимодействия гидролитического фермента ацетилхолинэстеразы (АХЭ) с ее субстратами по ряду причин. Во-первых, АХЭ играет первостепенную роль в процессе синаптической передачи нервных импульсов. Во-вторых, на ее примере видно, какие сложные и разнообразные задачи броуновского движения здесь приходится ставить и решать для понимания ее функционирования как молекулярной машины.

Фермент АХЭ, также как a-ХТ, является сериновой гидролазой. Он катализирует быстрый разрыв сложно-эфирной связи в молекуле нейромедиатора ацетилхолина (АХ). Если без a-ХТ невозможны процессы пищеварения, то без АХЭ невозможна синаптическая (химическая) передача электрического возбуждения от одного нейрона к другому или от нервных окончаний к мышечным волокнам.

Рассмотрим кратко процесс синаптической передачи. Синапс есть функциональный межмембранный контакт двух возбудимых клеток. В соответствии с механизмом передачи импульса от нейрона к нейрону синапсы делятся на химические, электрические и смешанные. Химические синапсы составляют большую часть синаптического аппарата центральной нервной системы высших животных и человека. Нервно-мышечная передача осуществляется посредством только химических синапсов.

Синапсы состоят из трех основных элементов: пресинаптической мембраны, постсинаптической мембраны и синаптической щели (рис. 6.1). Пресинаптической называется мембрана, покрывающая нервное окончание, которое представляет собой своеобразный нейросекреторный аппарат. Здесь содержится и выделяется медиатор, оказывающий возбуждающее или тормозящее воздействие на раздражаемую клетку. В межнейронных синапсах медиатором может служить ацетилхолин (АХ), адреналин, норадреналин, дофамин и некоторые другие вещества. В скелетных мышцах человека, как и всех позвоночных, роль медиатора играет АХ.

В пресинаптических окончаниях медиатор АХ содержится в "пузырьках" диаметром около 50 нм. При достижении распространяющегося потенциала действия области пресинаптического окончания АХ освобождается из "пузырьков" и выходит в синаптическую щель. При этом осуществляется принцип: один нервный импульс обеспечивает выход ограниченной порции молекул АХ. Напомним, что импульсы следуют с периодом порядка 1мс. Ширина щели составляет примерно 50 нм. Медиатор быстро диффундирует через щель, воздействуя на мембрану раздражаемой клетки. Та часть мембраны этой клетки, которая непосредственно граничит с нервным окончанием, называется постсинаптической. На постсинаптической мембране расположены ацетилхолиновые рецепторы, отвечающие на действие АХ изменением проницаемости для ионов

, что приводит к генерации потенциала действия в постсинаптическом мышечном волокне или в теле другого нейрона.

Рис. 6.1. Схема передачи нервного импульса в химическом синапсе.

1 - окончание пресинаптического нейрона; 2 - постсинаптический нейрон;

3 - пресинаптическая мембрана; 4 - постсинаптическая мембрана;

5 - синаптическая щель; 6 - пузырьки, содержащие нейромедиатор;

7 - высвобождаемый нейромедиатор; 8 - ацетилхолиновые рецепторы;

Установлено, что на постсинаптической мембране в больших концентрациях присутствует фермент АХЭ, способный расщеплять АХ на ацетат (А) и холин (Х). Он является одной из разновидностей молекулярных ножниц, о которых мы говорили ранее. Значение этого процесса становится ясным, если учесть, что в естественных условиях к постсинаптической клетке поступают быстро следующие друг за другом нервные импульсы, и постсинаптическая мембрана, деполяризованная предшествующей порцией АХ, становится малочувствительной к действию следующей порции. Чтобы идущие друг за другом нервные импульсы могли осуществлять нормальное возбуждающее действие, необходимо к моменту прихода каждого из них "убрать" предшествующую порцию медиатора. Эту функцию и выполняет АХЭ.

Существует ряд фармакологических агентов, обладающих способностью резко угнетать активность АХЭ. Их называют ингибиторами. Они используются для устранения мышечного расслабления при наркозе, а также при заболеваниях типа миастении. С другой стороны, известны отравления людей инсектицидами на основе этих ингибиторов. При этих отравлениях возникают судороги ¾ результат пролонгированной активации ацетилхолинергетических синапсов, особенно в вегетативной нервной системе. Большинство отравляющих веществ направляют свое действие на АХЭ.

Таким образом, изучение механизма работы данной молекулярной машины представляет собой важную задачу с точки зрения медицины и полезно для понимания общих принципов ферментативного катализа.

На сегодняшний день в Интернете содержится около 20000 статей, посвященных АХЭ.

Используя результаты рентгеноструктурного анализа, представим фермент набором жестко связанных неподвижных точек, относительное расположение которых соответствует расположению атомов в молекуле AChE. Для сравнения скорости выхода “осколков” из ущелья в случае закрытого и открытого “back door” используем две модели фермента. Первая модель соответствует молекуле AChE с закрытой “back door” и содержит все атомы, определенные рентгеноструктурным анализом. Вторая модель, соответствующая ферменту с открытой “back door”, должна иметь канал, через который продукты реакции могли бы покинуть ущелье активного центра. Поэтому из второй модели необходимо исключить некоторое количество атомов, определенных рентгеноструктурным анализом. Сделаем это следующим образом. Будем считать, что канал имеет цилиндрическую форму, радиус канала примем равным 5

. Путем варьирования направляющего вектора оси цилиндра и координат некоторой точки, лежащей на оси “back door”, определим такое положение канала, при котором в него попадает наименьшее число атомов фермента. Удалив оказавшиеся внутри канала атомы (принадлежащие остаткам Trp⁸⁴ и Met⁸³, что согласуется с приведенными в [9] данными), получим вторую модель фермента.

Субстрат и его “осколки” также представим набором жестко связанных точек. Однако, в данном случае для уменьшения времени счета не будем считать подвижные объекты состоящими из большого числа атомов, а отобразим молекулы ацетилхолина и холина в виде гантелей и молекулу ацетата в виде шара. Размеры гантелей и шара определим из результатов рентгеноструктурного анализа для соответствующих молекул.

Наделим каждую точку соответствующими массой и зарядом. Ван-дер-ваальсово взаимодействие двух точек, принадлежащих различным объектам (например, ферменту и продукту реакции), представим потенциалом Леннарда-Джонса:

где r - расстояние между точками; константы A и B для различных пар атомов приведены в [1]. Учет ударов молекул растворителя произведем по методу Ланжевена, т. е. введем в уравнения движения случайную силу [17].

Полагая фермент жестко закрепленным, будем описывать трансляционное движение подвижных объектов координатами и скоростями их центров масс. Для описания вращательного движения с центром масс каждого объекта свяжем подвижную систему координат. Ориентируем ее оси таким образом, чтобы тензор инерции принял диагональный вид. Это можно сделать следующим способом. В системе координат, связанной с центром масс, рассчитывается тензор инерции, определяются его собственные вектора и оси новой системы направляются вдоль собственных векторов. Тогда уравнения движения l-го тела запишутся наиболее просто [18]:

x_l, y_l, z_l - координаты центра масс в декартовой системе;

W_l1, W_l2, W_l3 - частоты вращений вокруг осей собственной системы координат;

- координаты i-ой точки тела в собственной системе координат;

x_lx, x_ly, x_lz - проекции случайной силы на оси лабораторной системы координат;

z_l1, z_l2, z_l3 - проекции случайного момента сил на оси подвижной системы координат;

g_l - коэффициент, учитывающий силу вязкого трения;

g_l1, g_l2, g_l3 - коэффициенты, учитывающие силу вязкого трения при вращательном движении;

- проекции силы

, приложенной к i-ой точке тела, на оси лабораторной системы;

- то же на оси подвижной системы координат.

Сила

учитывает ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия:

Здесь

- ван-дер-ваальсова сила, действующая на i-ю точку l-го тела со стороны j-ой точки другого тела (индекс j пробегает по всем точкам всех тел, за исключением l-го тела);

- заряд i-ой точки l-го тела;

- напряженность поля.

В процессе численного счета трансляционное брауново движение моделировалось следующим образом. Через равные интервалы времени

скорость центра масс l-го тела изменялась на величину

, где

- амплитуда добавочной скорости,

- равномерно распределенная в кубе [-1,1;-1,1;-1,1] случайная векторная величина. В остальное время тело двигалось согласно уравнениям (1) с нулевой случайной силой. Используя теорему о равнораспределении энергии по степеням свободы при диффузии в свободном пространстве в отсутствие электростатических полей

, получим следующее выражение для амплитуды шума:

Аналогичным образом моделировалось вращательное брауново движение. Через равные интервалы времени

угловая скорость вращения вокруг i-ой оси изменялась на величину

, где

- амплитуда добавочной угловой скорости, h_i - равномерно распределенная на отрезке [-1,1] случайная величина. Амплитуды добавочных угловых скоростей задаются следующей формулой:

В качестве примера рассмотрим определение скорости связывания субстрата с ферментом или константы k₁.

Константа k₁ определяет скорость образования комплекса E^S из независимых молекул фермента и субстрата:

Воспользуемся следующей схемой определения этой константы. Ограничим область вблизи основного входа в ущелье активного центра непроницаемыми для молекулы субстрата стенками в форме цилиндра (рис. 3.5). Поместим случайным образом в эту область молекулу ACh и промоделируем ее диффузию в поле, порождаемом ферментом. Если z-компонента координат субстрата становится меньше z₁, то считаем комплекс E^S образовавшимся. Многократно повторяя данный этап, определим частоту n образования комплекса E^S при условии, что молекула субстрата все время находится в данной области.

Рис. 3.5. Объем, ограничивающий область около входа в активный центр.

Пусть средняя по объему концентрация субстрата в выделенной области равняется [S]₁. Тогда среднее отношения времени t, когда субстрат находится в выделенной области, ко времени наблюдения T равняется

где V₁ - объем выделенной области. Записанное соотношение справедливо при условии [S]₁V₁<<1; иначе необходимо принимать во внимание те моменты времени, когда в объеме V₁ находятся две и более молекул субстрата.

Очевидно, при наличии только одной свободной молекулы фермента частота образования комплекса E^S равняется k₁[S]; следовательно,

Средняя концентрация [S]₁ субстрата в области V₁ выражается из распределения Больцмана следующим образом:

В процессе численного счета объем V₁ ограничивался плоскостью z₂=35

и цилиндром радиусом R=8

. Ось Oz являлась осью цилиндра. Значение z₁ было принято равным 20

. Для интегрирования уравнений движения субстрата использовался метод Эйлера с временным шагом 2*10^-14с. Одна из реализаций, полученных в ходе моделирования при нулевой ионной силе, представлена на рис. 3.6. По оси абсцисс здесь отложено время моделирования, по оси ординат - количество образовавшихся за это время E^S-комплексов. По нескольким реализациям, аналогичным отображенной на рис. 3.6, определялось среднее значение и границы 66%-го доверительного интервала для частоты n. Для искомой константы скорости, исходя из уравнения (3.10), получена отображенная на рис. 3.7 зависимость k₁ от ионной силы.

Рис. 3.6. Зависимость количества образовавшихся E^S-комплексов N

от времени моделирования при нулевой ионной силе.

Рис. 3.7. Зависимость константы скорости k₁ от ионной силы I.

Указанные погрешности соответствуют 66%-му доверительному интервалу.

Рассматривалась возможность объяснения эффекта субстратного торможения увеличением времени выхода продуктов реакции из ущелья. Это рассмотрение могло бы дать ответ на вопрос о том, имеется ли “back door” в молекуле AChE. Действительно, если бы рассчитанное значение [S]_опт для молекулы фермента без “back door” оказалось значительно меньше экспериментального, мы имели бы аргумент в пользу наличия дополнительного канала в ущелье активного центра. Однако даже при концентрации субстрата, на порядок превосходящей экспериментальное значение [S]_опт, среднее время выхода оставалось на четыре порядка меньше времени, определяющего химические стадии реакции. Таким образом, на основании имеющихся экспериментальных данных мы не можем утверждать, что в молекуле AChE происходит открытие дополнительного канала в ущелье активного центра.

Таким образом мы рассмотрели математическую модель связывания субстрата. С моделями других этапов работы молекулярных ножниц можно ознакомиться по монографиям [1,2].

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычислить, когда этот...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: