|
ВИРОБНИЦТВО ФАРМАЦЕВТИЧНИХ ПРЕПАРАТІВ НА ОСНОВІ МІКРОБІОЛОГІЧНОГО СИНТЕЗУ. ФЕРМЕНТИОсновний напрям мікробіологічного синтезу — використання клітин мікроорганізмів для виробництва ферментів, антибіотиків, вітамінів, алкалоїдів, амінокислот, органічних кислот, полісахаридів та ін. Промислове виробництво ферментних препаратів здійснюють в основному з культур мікроорганізмів (табл. 12.4): плісеневих грибків, бактерій, дріжджів, актиноміцетів. Останніми роками для промислового виробництва ферментів використовують в основному міцеляльні гриби родів Aspersillus, Penicillinum і Rhizopus, а також організми-продуценти бактерій роду Bacillus, Escherihia coli та інших. Вони здатні продукувати велику кількість різноманітних за своїм складом ферментів, що обумовлено специфічними можливостями їх ферментативного апарата, високою здатністю до розмноження та адаптації в різних умовах навколишнього середовища. Використовуючи культури мікроорганізмів, можна набагато швидше одержати велику кількість біологічного матеріалу (біомаси) для наступного виділення ферментів. Для харчування мікробних клітин можуть бути використані різноманітні продукти і відходи харчової промисловості (пшеничні і рисові висівки, картопляна мезга, пшеничне лушпиння, соняшникова лузга тощо). До вад мікробної сировини слід віднести значний обсяг роботи, який передує препаративному виділенню ферментів (добір, вирощування і ведення штамів-продуцентів, підготовку живильних середовищ, дотримання умов стерилізації, вирощування, висушування тощо). 12.3.1. СИРОВИНА ДЛЯ МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ ПРОМИСЛОВОСТІ Для приготування живильних середовищ мікробіологічної промисловості використовують сировину мінеральну, тваринного і рослинного походження, а також синтезовану хімічним шляхом. Речовини, що входять до складу живильного середовища і які забезпечують розвиток культури і біосинтез обумовлених продуктів, не повинні містити шкідливих домішок. При виборі сировини необхідно враховувати його собівартість, оскільки в мікробіологічному синтезі важливого значення набуває вартість вихідних речовин і матеріалів. Джерела вуглецю. Найбільш доступні для мікроорганізмів вуглеводи, тому в лабораторіях, а також у багатьох промислових біотехнічних процесах (у виробництві ферментів, антибіотиків, амінокислот тощо) використовують глюкозу, сахарозу, лактозу та інші вуглеводи. Однак зазначені вуглеводи є цінною харчовою сировиною і досить дорогі. У зв'язку з цим у більшості багатото-нажних мікробіологічних виробництв чисті вуглеводи заміняють більш дешевими і доступними продуктами: відходами крохмально-потокового виробництва (меляса, гідрол), гідролізатами торфу і рослинних відходів, побічними продуктами молочної промисловості та ін. Меляса — відходи виробництва цукру із цукрового буряка, багаті на вуглеводи та інші цінні органічні і мінеральні речовини. Меляса містить 70—80 % сухої речовини, у тому числі 45—60 % сахарози, 0,25—2 % інвертного цукру, 0,2—3 % рафінози, 1,2— 3,4 % азотистих речовин. У її склад входять амінокислоти, органічні кислоти і солі, мінеральні речовини, деякі вітаміни. Меляса широко використовується у виробництві амінокислот, ферментів, дріжджів.
Гідрол — відходи виробництва глюкози з крохмалю. Вміст глюкози складає до 80 % суми цукрів, а інші 20 % — в основному продукти неповного гідролізу крохмалю. Поряд із цукром гідрол містить органічні кислоти, мінеральні елементи (фосфор, магній, залізо, натрій). Гідрол використовують як дешевий замінник у хіміко-фарма-цевтичних виробництвах. Крохмаль картопляний (або кукурудзяний) містить 98,5— 98,8 % крохмалю, 0,4—0,6 % білків, 0,6—0,7 % жирів, 0,12— 0,17 % зольних елементів. Крохмаль використовують у ферментній, хіміко-фармацевтичній промисловості для вирощування мікроорганізмів, що мають аміло-літичну активність. Кукурудзяна мука — субстрат, який містить 60—70 % крохмалю, близько 10 % інших вуглеводів, 10—12 % білків, 3 % жирів, 0,8— 1 % зольних елементів. її використовують в основному у виробництві антибіотиків. Пшеничні висівки — відходи борошномельного виробництва, використовуються для приготування живильних середовищ при твердо-фазному способі культивування. Висівки містять 16—20 % крохмалю, 10—12 % білків, 3—4 % жирів, 10 % клітковини. Джерела органічного азоту. Для вирощування мікроорганізмів широко використовують субстрати, які містять органічні джерела азоту (амінокислоти, білки). Найбільш поширені в біотехнології натуральні субстрати — кукурудзяний екстракт, соєва мука, буряковий жом та інші досить доступні та дешеві. Кукурудзяний екстракт — побічний продукт крохмально-патокового виробництва, що містить 40—50 % азотистих речовин, в основному амінокислоти, і 10—12 % вуглеводів, вітамінів, мікроелементів. Соєва мука — багате джерело органічного азоту, в основному у вигляді білків. Крім білків, у ній міститься до 20 % вуглеводів, які здебільшого важко засвоюються організмом, 4,5—6,5 % мінеральних елементів, деякі вітаміни. Буряковий жом — відходи цукрового виробництва із цукрового буряка. Він містить: білків — 8,9, жирів — 0,23, целюлози — 21,7, зольних елементів — 4,2, кальцію — 4,7, фосфору — 1,2 %. Інші види сировини. Крім основних компонентів живильних середовищ, у процесі ферментації часто використовують додаткові види сировини — попередники, поверхнево-активні речовини (ПАР), антибактеріальні препарати та ін. Попередники — синтетичні продукти, що входять до складу молекули цільового продукту і які додають у ферментаційне середовище для інтенсифікації процесу біосинтезу. Наприклад, при біосинтезі пеніциліну в культуральну рідину додають як попередник кислоту фенілоцтову, при біосинтезі еритроміцину — спирт пропіловий, вітамінів В12 — 5,6-диметилбензимідазол. Поверхнево-активні речовини в біологічних виробництвах використовують головним чином для піногасіння. Антибактеріальні препарати (фурадонін, фурацилін) — для підтримки асептичних умов. 12.3.2. ТЕХНІЧНІ ЗАСОБИ ДЛЯ РЕАЛІЗАЦІЇ ПРОЦЕСІВ ФЕРМЕНТАЦІЇ. ФЕРМЕНТАТОРИ У мікробіологічних виробництвах використовують різноманітні ферментатори. Умовно їх можна поділити на такі типи: барботажні, ерліфтні, барботажно-ерліфтні з механічним перемішуванням, барботажні з циркуляційним перемішуванням, з ежекційною системою та ін. За структурою потоків ферментатори можуть бути апаратами повного перемішування або повного витіснення. За способом введення енергії і аерації розрізняють апарати із введенням енергії в газову фазу, у рідку фазу або комбіновані. Об'єм виробничих ферментаторів може бути від 10 до 1000 м3 із механічним перемішуванням і барботажем. Ферментатори зазвичай являють собою герметичні циліндричні посудини, висота яких у 2—2,5 рази перевищує діаметр, найчастіше їх виготовляють із нержавіючої сталі. У ферментаторах установлюють мішалки турбінного, пропелерного та іншого типів. Діаметр мішалки становить приблизно 1/3 діаметра апарата. У виробництві ферментів поширені ферментатори з мішалками, під якими знаходиться кільцеподібний або радіальний повітряний барботер. Для підтри-
Птогасник мування температури в апараті є по- Повітря Компоненти • «~ - -. 1 1 \ середовища двіинии кожух або теплообмінник на l зразок змійовика. Ферментатор облад- наний арматурою і трубопроводами для подачі живильного середовища; води і пари; розчину, що регулює pH; піногасників; повітря та інших матеріалів. Сучасні ферментатори укомплектовують вимірювальними приладами і регулювальними приладами для піногасіння, оглядовими люками. Найголовніша вимога до апара Робочий об'єм ферментатора звичайно не перевищує 6/10 загального об'єму. Вільний простір над поверхнею розчину використовується як буферний, де накопичується піна, і таким чином запобігаються втрати культуральної рідини. Дослідження показали, що в рідині, яка піниться, умови аерації кращі, ніж у перенасичених розчинах, за умови постійного перемішування і циркуляції шару піни, тобто при неможливості тривалого перебування мікроорганізмів поза культуральною рідиною. В інституті мікробіології ім. Кірхенштейна AH Латвії створено ферментатор колонного типу об'ємом 100 м3 з контактними пристроями (рис. 12.1). Системи очищення повітря Для забезпечення киснем культури мікроорганізмів в умовах аеробного процесу при глибинній ферментації через одиницю об'єму живильного середовища за 1 хв необхідно продути 0,5—2 об'єми повітря. Його треба очистити від механічних частинок, мікроорганізмів і хімічних речовин перед введенням у ферментатор. Для очищення повітря зазвичай застосовують фільтрацію (рис. 12.2). Повітря подають у систему під тиском 0,2 МПа. Для створення тиску найчастіше використовують турбо- або поршневі компресори. Перед подачею в компресор повітря очищується від грубих частинок на масляних фільтрах. У ферментаторі воно проходить через фільтри: спочатку через загальний, потім через індивідуальний. Ці фільтри виконують функцію холодної стерилізації повітря. Фільтри заповнюють гранульованим зернистим або волокнистим фільтрувальним матеріалом, використовуючи гранульоване вугілля і скловату, діаметр волокон яких 18 мкм. Останнім часом почали використовувати спеціальне бактерицидне волокно. Товщина фільтрувального шару зазвичай складає 0,4—0,75 м. Індивідуальні фільтри часто заповнюють скловатою або бавовняною ватою, активованим вугіллям. Тривалість експлуатації фільтрів 1—1,5 год при температурі 120— 126 °С. Після стерилізації їх сушать у потоці сухого повітря протягом 2—3 год. Фільтрувальний матеріал в індивідуальних фільтрах заміняють через 1—2 місяці, у загальних — через 6—8 місяців. Затримуюча спроможність фільтра: де N^ — кількість мікроорганізмів у потоці атмосферного повітря, що наступає; N2 — теж саме на виході з фільтру. Як фільтрувальний матеріал можуть бути використані і спеціально виготовлені пластинки, наприклад полівінілові, завтовшки 1—2 мм із порами певного розміру. В обслуговуванні пластинчасті фільтри простіші, ніж фільтри із скловолокном. Системи контролю і керування Щоб процес ферментації зробити керованим, оператор має постійно отримувати інформацію про хід розвитку біологічного агента і динаміки середовища культивування. Основні показники, що характеризують ферментаційний процес такі:
Фізичні показники: температура; тиск; введена потужність; частота обертання мішалки; піноутворення; швидкість потоку газу (повітря); швидкість потоку середовища; в'язкість; турбулентність. Хімічні показники: pH середовища; окисно-відновний потенціал; вміст розчиненого 02 і С02; вміст 02 і С02 у газі; вміст вуглецю; вміст попередника: азоту, фосфору; Mg2+, K+, Ca2+, Na+, Fe2+, SO2- тощо. Найважливішим показником процесу ферментації є вміст біомаси, субстрату, продукту і відсутність забруднення сторонньою мікрофлорою. Фізичний стан продуцента характеризує питома швидкість росту, його морфологічний стан (розмір клітин, кількість клітин, що діляться,), а також багато біохімічних показників (вміст PHK, ДН, НАД, НАДН, ATP, AMP, активність ключових ферментів). Більшість хімічних показників визначають, періодично відбираючи пробу, фізичні показники — постійно за допомогою вмонтованих у ферментатор датчиків. Для біотехнічних процесів істотне значення має не тільки температура і pH середовища, але й вміст розчиненого кисню. Для визначення pH і розчиненого кисню застосовують стерильні електроди, вмонтовані безпосередньо у ферментатор. Для визначення розчиненого кисню застосовують амперметричні срібно-свинцеві або срібно-золоті електроди. Істотний вплив на хід процесу ферментації має ступінь піноутворення субстрату. Для субстратів, що дуже піняться, використовують автоматизовані системи піногасіння, що включають як хімічні, так і механічні засоби (рис. 12.3). Сучасний біотехнічний процес немислимий без застосування ЕОМ для керування процесом ферментації: підтримка оптимальної величини pH, температури, піноутворення, частоти обертання мішалки, кількості розчинного кисню, швидкості подачі субстрату тощо (рис. 12.4). 12.3.3. ГЛИБИННИЙ АЕРОБНИЙ ПЕРІОДИЧНИЙ ПРОЦЕС Цей відносно сучасний метод має великі переваги впорівнянні з більш ранніми методами поверхневого культивування. Застосування глибинного методу дозволяє підвищити ефективність використання виробничих площ, збільшити масштаби виробництва, механізувати трудомісткі роботи і майже цілком автоматизувати технологічний процес одержання біопродукту. Крім того, вихід продукту підвищується, а небезпека зараження зменшується, хоча технології поверхневого способу культивування більш економні, оскільки при його застосуванні собівартість продукту і витрата електроенергії значно менші. Більшість промислових ферментацій здійснюють періодичним способом. При глибинному способі культивування розмноження посівного матеріалу зазвичай відбувається у дві стадії: у цеху чистої культури та у відділенні інокуляції. Кількість живильного середовища в апараті не повинна перевищувати 60 % від загального об'єму. Якщо культуру в інокулятор вносять із колб, то кількість посівного матеріалу складає приблизно 0,1 % від об'єму середовища. Така невелика кількість посівного матеріалу вимагає тривалого періоду інокуляції (2—4 доби). Для посівних ферментаторів використовують 10—12 % інокуляту від загального об'єму середовища, тому за тривалістю приготування посівного матеріалу треба стежити, щоб в апараті був оптимальний режим культивування. Три рази в сушці збирають зразки для мікробіо- логічного і біохімічного аналізів. Посівний матеріал для основної ферментації готують у кількості 5—20 % від об'єму використовуваного живильного середовища. 12.3.4. ГЛИБИННИЙ БЕЗПЕРЕРВНИЙ ПРОЦЕС Процес ферментації може бути гомогенно або гетерогенно безперервним. При гомогенно безперервному процесі в апараті, де відбувається інтенсивне перемішування, усі параметри незмінні в часі. При гетерогенно безперервному процесі декілька ферментаторів з'єднані в батарею. Живильне середовище надходить у перший апарат, готова культуральна рідина витікає з останнього. Культивування мікроорганізмів у протоці через систему трубок відбувається також за принципом гетерогенно безперервного процесу. У цьому разі має місце безперервний потік живильного середовища, але клітини не забезпечені постійними умовами росту (скільки апаратів, стільки й умов культивування). При безперервному культивуванні мікроорганізмів важливо регулювати швидкості притікання живильного середовища і витікання куль-туральної рідини, щоб запобігти вимиванню культури із системи. У стерильних умовах безперервний проточний метод забезпечує зберігання культури у фізіологічно активному стані тривалий час. Безперервний процес можна використовувати в тому разі, якщо культура при тривалому вирощуванні не втрачає здатності до синтезу (мутації, реверсії). При розробці методу безперервного культивування мікроорганізмів необхідно встановити оптимальний склад середовища, швидкість подавання живильного середовища, температуру, pH, аерацію тощо. 12.3.5. ТВЕРДОФАЗНА ФЕРМЕНТАЦІЯ Культивування на поверхні твердого середовища, як правило, здійснюють у зволоженому твердому, сипучому або пастоподібному середовищі, вологість якого становить 30—80 %. Якщо субстрат сипучий, то його окремі тверді частинки добре контактують із повітрям. Ріст мікроорганізмів у цьому разі відбувається головним чином на поверхні твердих частинок, а також у порах, заповнених водою або повітрям. Забезпечення мікроорганізмів киснем утруднюється із зволоженням шару субстрату. Перемішування шару не допускається, якщо культивуються міцеляльні мікроорганізми. Інша проблема при твердофазній ферментації — відведення теплоти і підтримка сталої тёмператури в усьому ферментаційному середовищі. Метод твердофазної ферментації широко використовують в Японії для виробництва грибкових ферментів кислоти лимонної. У Німеччині, Франції, Великій Британії від нього відмовилися, оскільки він вимагає занадто великих площ для експлуатації. Крім того важко запобігти зараженню мікроорганізмами, а вихід продукту біосинтезу невеликий. Наприклад, у виробництві грибкової амілази головним компонентом живильного середовища є суміш пшеничних висівок і крохмалю, іноді до них додають білкові відходи, солодові паростки, одержані у виробництві пива, соєву муку і т. ін. Для вирощування виробничої культури компоненти живильного середовища змішують, розподіляють тонким шаром у кюветах, зволожують міцеляльним розчином, який містить невелику кількість кислоти хлороводневої, стерилізують при тискові 0,15 МПа протягом 1 год або гострою парою протягом 30 хв, а потім охолоджують. В охолоджене до 35 °С живильне середовище вносять суспензію спор Aspergillus oryzae. Стерильне, засіяне спорами Aspergillus oryzae живильне середовище в кюветах поміщають у камери для вирощування, в які подають очищене повітря, з певною температурою і відносною вологістю. Через 30—36 год інкубації для культури гриба Aspergillus oryzae в цих камерах при температурі 30 °С розвивається маса споротвірного міцелію. Масу знімають, висушують і здрібнюють для одержання сирої амілази або екстрагують для одержання очищеної амілази. Схема вирощування культури Aspergillus oryzae наведена на рис. 12.5. Технологічний процес поверхневого культивування цієї культури складається із семи стадій: 1. Введення (одержання і підтримка росту) чистої культури в лабораторних умовах. 2. Приготування посівного матеріалу у відділенні чистої культури. 3. Підготовка живильного середовища. 4. Вирощування виробничої культури. 5. Здрібнення готової культури. 6. Сушіння. 7. Розфасовка і упаковка готової продукції. Описана схема поверхневого культивування вимагає значних затрат ручної праці. Більш сучасний варіант, запропонований для великотоннажного виробництва поверхневих культур плісеневих грибків, передбачає використання механізованих установок для вирощування із рознімними касетами і автоматичним розвантаженням. При цьому виникає можливість вирощувати за добу 1,2 т культури грибка. Така автоматизована система конструкції РНДІФС (рис. 12.6) існує на Вишньоволоцькому заводі ферментних препаратів, який здійснює випуск лікарського ферментного препарату ораза з поверхневої культури грибка Aspergillus oryzae.
Підготовлене, простерилізоване і засіяне культурою грибка Aspergillus oryzae живильне середовище завантажується в камери вирощування і по рельсах подається у відділення вирощування, через дифузори до камер подається кондиціоноване повітря. Ae-рування культури здійснюється через вертикальні канали, що знаходяться між кюветами, і через отвори в стінках кювет. Система аерації розрахована на рециркуляцію та очищення потоку повітря, підсмоктування свіжого повітря і підтримку умов, що запобігають підсиханню культури, яка вирощується. Процес культивування проводять протягом 42—46 год. Після цього проводять розвантаження камер вирощування на вібраційному столі, відділивши попередньо вертикальну стінку кювети. Звільнена від культури камера переміщається по рельсах у відділення промивки, потім у стерилізатор і на вібраційний стіл для нового завантаження. Використання механізованої лінії з вирощування культури грибка Aspergillus oryzae дає можливість підтримувати високий рівень стерильності, що дуже важливо для цілеспрямованого синтезу амілази. У разі потреби можна оперативно локалізувати й ізолювати інфікований матеріал, виключаючи небезпеку зараження супутньою мікрофлорою інших камер. Вирощену поверхневу культуру грибка передають на стадію екстракції, минаючи операцію сушіння, здрібнювання і фасування, які мають місце при серійному виробництві «амілорозину — П». 12.3.6. ГЛИБИННА ФЕРМЕНТАЦІЯ Промисловий спосіб глибинної ферментації — складний багатоступінчастий процес, який включає декілька технологічних стадій. Нижче наведено основні з них. 12.3.6.1. ПЩГОТОВКА СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТУ I ПОСІВНОГО МАТЕРІАЛУ (I СТАДІЯ) Приготування і стерилізація живильного середовища. Живильні середовища готують у спеціальних реакторах із міЩалками. Реактори, ферментатори, трубопроводи, арматуру найчастіше виготовляють із нержавіючої сталі, особливу увагу
звертають на зручність для стерилізації живильних середовищ, які використовують як для приготування чистої культури, так і в цехах основної ферментації. Середовище готують у сировинному або рецептурному цехах періодичним або безперервним методом, в окремих випадках приготування і стерилізацію його здійснюють у ферментаторі. На сучасних заводах застосовують безперервний метод приготування. Для цього використовують два резервуари: в один уводять вихідні речовини, а з іншого рідина витікає в змішувач безперервної дії. А потім за допомогою насоса подається в колону для стерилізації, одночасно з якою використовуються парові інжектори, або теплообмінник — труба в трубі. При роботі з вертикально встановленою стерилізаційною колоною живильне середовище підводять знизу в простір між трубами. У верхню частину колони подають пару під тиском 0,3— 0,4 МПа. Швидкість потоку середовища вибирають таку, щоб кожна частинка живильного середовища знаходилася в зоні прогрівання відповідний час. Якщо для стерилізації середовищ застосовують відносно високу температуру (135 °С і вище) і об'єм витримування не перевищує декілька десятків літрів, замість резервуарів використовують систему вертикально закріплених труб. Теплообмінники пластинчастого типу використовують для нагрівання і охолодження середовища, процес стерилізації в них легко автоматизується. Вибір апаратури, технології приготування і стерилізації живильного середовища залежить від кількості і виду компонентів, які попередньо розчиняють у підігрітій або гарячій воді. Якщо за ступенем розчинності і стерилізації це можливо, то всі компоненти розчиняють в одному розчині та в певній послідовності. У противному разі їх розчиняють по окремих групах вихідних речовин, виходячи з їхніх фізико-хімічних властивостей, стерилізують і з'єднують у змішувачі. Якщо середовище стерилізують у невеликих кількостях, весь об'єм середовища доводять до температури 120 °С безпосередньо у ферментаторі або спеціальних котлах-стерилізаторах, витримують протягом 30—60 хв (залежно від об'єму середовища і його складу) при 120 °С, а потім охолоджують до 27—30 °С. Приготування посівного матеріалу. Штами-продуценти ферментів підприємства мікробіологічної або хіміко-фармацевтичної промисловості отримують з академій і університетів України і країн СНД у пробірках на зрізах агару або в ампулах. Кожна культура має паспорт із докладним описом морфології, характеристики середовища для культивування і збереження. Перед початком технологічного процесу культуру розмножують у стерильних умовах на оптимальному складі середовища і при дотриманні режиму вирощування (pH, температура, тривалість). 3 поверхні зрізу агару її стерильно переносять у колбу місткістю 100—200 мл та інкубують у термостаті. Тривалість кожної стадії вирощування 24 год. Подальше розмноження посівного матеріалу зазвичай проводять у два етапи: в цеху чистої культури та у відділі інокуляції. Апарати першого етапу вирощування часто називають іноку-ляторами, другого — посівними ферментаторами. 12.3.6.2. ОСНОВНА ФЕРМЕНТАЦІЯ. РОЗВИТОК ОРГАНІЗМУ-ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТУ У ФЕРМЕНТАТОРАХ (II СТАДІЯ) Для стерильної основної ферментації широко використовують апарати об'ємом до 100 м3. Перед заповненням основного ферментатора середовищем його і систему трубопроводів промивають водою, стерилізують гарячою парою під тиском, після чого заповнюють охолодженим живильним середовищем. Посівний матеріал для основної ферментації готують у кількості 5— 20 % від об'єму використовуваного середовища. Процес розвитку мікроорганізму у ферментаторах проходить при суворому контролі всіх стадій, точному виконанні регламенту, умов розвитку організму-продуцента ферменту. Особлива увага приділяється підтримці заданої температури культивування, активної кислотності, pH середовища, ступеня аерації і швидкості обертання мішалки. Враховується споживання організмом основних поживних компонентів (джерела вуглецю, азоту та інших видів сировини), пильно контролюється утворення ферменту. Особливу увагу при розвитку продуцента у ферментаторах звертають на процес піногасіння. При продуванні повітря через культуру мікроорганізму часто відбувається сильне утворення піни, що суттєво порушує перебіг всього процесу розвитку продуцента ферменту у ферментаторі. Основна причина появи великої кількості піни — наявність білкових речовин у середовищі і його висока в'язкість, зумовлена накопиченням біомаси. Для боротьби з піноутворенням у ферментаторах використовують різні ПАР: рослинні олії (соєву, соняшникову), тваринний жир (лярд, кашалотовий жир), а іноді й мінеральні масла (вазелінове, парафінове), спирти і вищі жирні кислоти. Часто як піногас-ники використовують спеціально синтезовані речовини (силікони, діазобутал-карбаміл та інші сполуки). Багато речовин (олії, жири, спирти та ін.) — піногасників споживаються продуцентами ферментів як додаткові джерела вуг-
лецевого живлення. При цьому часто спостерігається підвищення виходу ферменту. Однак внесення піногасника знижує швидкість розчинення кисню, що у свою чергу може негативно вплинути на розвиток мікроорганізму і його біосинтетичну активність. Іноді використовуються механічні способи піногасіння (відсмоктування піни через спеціальні труби, руйнація бубльбашок піни сильними струменями рідини, пари або газу і аеродинамічні). Ферментацію припиняють, коли в середовищі накопичується максимальна кількість корисного продукту. По закінченні процесу культуральну рідину охолоджують до 5—10 °С для забезпечення стабільності продукту і запобігання росту інших мікроорганізмів і перекачують у резервуари, з яких вона поступово подається на подальшу переробку (рис. 12.7). 12.3.6.3. ПОПЕРЕДНЯ ОБРОБКА КУЛЬТУРАЛЬНОЇ РІДИНИ До складу культуральної рідини входять залишки використаного живильного середовища, синтезовані метаболіти і клітинна маса продуцента. Для виділення продуктів біосинтезу використовують сепаратори, осаджувальні центрифуги, фільтрпреси, вакуум-барабанні фільтри, ротаційно-вакуумні фільтри, відстійники. Вибір обладнання залежить від масштабу ферментації, типу клітин, властивостей культуральної рідини, місця локалізації ферментів (у клітині, клітинній стінці, культуральній рідині). Стадія попередньої обробки культуральної рідини в деяких технологіях виробництва ферментів включає операцію руйнації клітин і клітинних стінок за допомогою гомогенізаторів високого тиску, ультразвуку, хімічною обробкою (електроліти, поліелект-роліти, луги) і ферментаційні методи. Біомасу грибків звичайно збирають прямим центрифугуванням культуральної рідини або сепаруванням. Бактеріальні клітини вимагають попередньої обробки культуральної рідини шляхом флокуляції у крупніші коагулюючі скупчення для збільшення ефективності їх поділу в центрифузі. При нейтральній реакції середовища бактеріальні клітини в культуральній рідині мають негативний заряд, обумовлений фосфатними або карбоксильними групами клітинної стінки. Флоку-люючі агенти (амонію сульфат, кальцію хлорид) нейтралізують заряд і сприяють утворенню великих агрегатів клітин, які легко осідають із культуральної рідини. Після попередньої обробки культуральну рідину центрифугують або декантують. Альтернативою центрифугуванню служить фільтрація. Для фільтрації невеликих об'ємів культуральної рідини використовують нутч- і друк-фільтри, вакуум-барабанні і ротаційно-вакуумні фільтри. Прес-фільтри застосовують для обробки великих об'ємів рідини. 12.3.6.4. ВИДІЛЕННЯ ТА ОЧИЩЕННЯ ФЕРМЕНТУ Стадія виділення і хімічного очищення включає низку процесів: від обробки нативного розчину до сушіння готового продукту. Звичайно після центрифугування біомасу отримують у вигляді густої рідини або пасти із вологістю 70—85 %. Клітинну масу промивають, фільтрують, сушать, гідролізують, екстрагують із неї
необхідний фермент. Якщо ферменти знаходяться в розчині, біомасу використовують після відділення як побічний продукт, а потрібну речовину виділяють із розчину різними методами: осадженням, фільтрацією, екстракцією тощо. Для одержання високоочищеного ферменту застосовують висолювання, діаліз, електродіаліз, мембранну фільтрацію, гель-фільтрацію, іонообмінну хроматографію, афінну хроматографію, різні методи сорбції. Концентрування розчинів, які містять ферменти, здійснюється ліофілізацією, вакуум-випарюванням, виморожуванням. 12.3.6.5. ОДЕРЖАННЯ ГОТОВОЇ ПРОДУКЦІЇ (V СТАДІЯ) Після виділення і хімічного очищення ферменту його необхідно висушити — видалити з отриманого препарату вільну і зв'язану воду. Оскільки ферменти в основному термолабільні, для їх висушування необхідно застосовувати методи, які не призводять до втрати біологічної активності. На сучасному етапі промислового одержання ферментів, використовують різні методи зневоднення препаратів. Широкого поширення набуло ліофільне сушіння ферментів, що здійснюється при порівняно низьких температурах (від -10 до -15 °С). При роботі із значними об'ємами розчину, що містить ферменти, проводять висушування із застосуванням розпилювальних сушарок. Однією з важливих операцій хімічного очищення ферментів є кристалізація. Залежно від хімічної будови ферменту і його фізико-хімічних властивостей застосовують такі методи кристалізації: випарювання розчинника (ізотермічний), охолодження гарячого розчину (ізогідричний), одночасне охолодження і випарювання (комбінований), додавання в розчин інших речовин, які знижують розчинність (висолювання), виморожування. Після висушування препарат, якщо він нестійкий, необхідно змішувати із стабілізатором або з наповнювачем (крохмалем, декстринами, неорганічними нейтральними сполуками, тальком тощо). 12.3.7. ІММОБІЛІЗАЦІЯ I СТАБІЛІЗАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ Іммобілізація ферментів — це підвищення їхньої стабільності. Як відомо, у клітинах ферменти знаходяться частіше в «незв'язаній» формі, тобто прикріплені до певних структур і локалізовані в органелах. Тому ферменти характеризуються нестабільністю у разі дії низки фізичних і хімічних чинників і можуть інактивуватися. Це має місце і при одержанні ферментів мікробіологічним шляхом, тому після досягнення у ферментаторі максимальної активності ферментів необхідно якнайшвидше провес- ти їх виділення. Причиною зниження активності можуть бути протеази, які виділяються в середовище при автолізі клітин продуцента або в мікроорганізми, що утилізують фермент. При використанні ферментних препаратів для каталізу різних реакцій вільні ферменти досить чутливі до температури, pH середовища, наявності різних речовин. Дію цих чинників може денатурувати білок. Крім того, вільні ферменти можуть бути використані лише одноразово, їхня вартість досить висока. Досягнення молекулярної біології сприяли детальному вивченню будови багатьох ферментів. Був розкритий амінокислотний склад багатьох ферментних білків, їх просторова конфігурація, виявлені активні центри, значення різних функціональних груп у виявленні каталітичної активності ферменту. Це дозволило створити теоретичну базу для виробництва ферментів пролонгованої дії або, як їх називають, іммобілізованих, фіксованих, або зв'язаних ферментних препаратів. Сутність іммобілізації ферментів — прикріплення їх в активній формі до нерозчинної основи, включення в гель або в напівпроникну мембранну систему. Методи іммобілізації ферментів можна розділити на дві групи: включення в гель мікрокапсули і зв'язування з носієм адсорбційним або ковалентним зв'язком. Найчастіше використовувані методи іммобілізації показані на рис. 12.8. Схеми б і д стосуються першого методу, інші — другого. Допускається прикріплення ферментів тільки за допомогою функціональних груп, які не входять до активного центра і не беруть участь в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту, або матриця, може мати вигляд зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин,
порожнистих волокон, трубочок, капсул тощо. Має значення розмір частинок носія, важливо, щоб він мав велику поверхню, тому рекомендується використовувати невеликі частинки діаметром 0,1—0,2 мм. Носій ферменту може бути як природною (нативною) речовиною, так і синтетичним полімером. Для іммобілізації широко застосовують целюлозу і її похідні — кислу карбоксиметилце-люлозу і ацетилетилцелюлозу та ін. У воді целюлоза набухає, і її гідроксильні групи приєднують ділянки молекул ферменту. Із синтетичних носіїв можна назвати карбоксильні або сульфоксильні хлориди у вигляді полімерних іонообмінних смол, діазотований поліаміностерин, нітратні кополімери кислоти метакрилової та ін. Процес іммобілізації ферментів можна продемонструвати на прикладі зв'язування глюкоамілази з носієм ацетилетилцелюлози. Носій спочатку витримують протягом доби в очищеній воді для набухання. Потім при перемішуванні до ацетилетилцелюлози, що набухла, додають спочатку натрій-ацетатний буфер (pH = 5,53), потім — розчин очищеного ферменту. Після перемішування вносять поперечно-зшивальний агент — глутаровий альдегід, який утворює амідний зв'язок між аміногрупою носія і карбоксильною групою ферментного білка. Через кілька годин отриманий препарат промивають послідовно натрій-ацетатним буфером і розчином натрію хлориду для видалення сорбованого на носії білка. Іммобілізований у такий спосіб фермент зберігають під шаром води або буфера при температурі 3—5 °С. Ферменти можна прикріплювати до поверхні носія шляхом сорбції до іонітів: до катіонів (які містять активні кислотні групи) або до аніонітів (які містять переважно основні групи). Як сорбенти — носії ферментів часто використовують гель алюмінію гідроксиду або кальцію фосфату, діатоміт, модифікований крохмаль, бентоніти, кізельгур та ін. Сорбцію ферментів здійснюють або в колонках пропусканням розчину ферменту з певною швидк Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)... Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все... ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры... Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор... Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:
|