Работа 6. Исследование денатурации белков

Вещества, нарушающие структурную организацию белковой молекулы (т.е. четвертичную, третичную и даже вторичную структуры), приводят к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Это явление называется денатурацией.

Денатурирующие факторы делятся на химические, физические и биологические. Наиболее обширны группы химических факторов (кислоты, тяжелые металлы, алкалоиды, поверхностно-активные вещества и т.д.) и физических факторов (температура, ионизирующая радиация, ультразвук и т.д.). Биологическую денатурацию могут вызвать протеолитические ферменты (например, трипсин), которые разрушают высшие уровни организации молекулы белка перед тем, как гидролизовать ее пептидные связи.

Денатурация изменяет физико-химические свойства белка, в частности, его растворимость. При этом белок становится менее гидрофильным и легко осаждается. Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев удаление денатурирующих агентов приводит к восстановлению исходной конформации молекулы белка и его природных свойств – ренатурация.

Реактивы. Азотная кислота, конц.; сульфат меди, 5%-ный раствор; сульфат свинца, 5%-ный раствор; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; хлорная кислота, 10%-ный раствор; этиловый спирт, 96%-ный; ацетон.

Оборудование. Штатив с простыми пробирками; пипетки; водяная баня.

Материал. Раствор яичного белка (приготовление см. работу 1).

а. Денатурация белка концентрированными минеральными кислотами. Метод основан на способности минеральных кислот вызывать нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры белка, что приводит к его денатурации и осаждению.

Ход определения. В пробирку наливают 10 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно, держа пробирку под углом 45˚, наслаивают на кислоту 5 капель раствора яичного белка. Отметить изменения на границе двух слоев жидкостей (кольцо денатурированного белка).

б. Денатурация белка органическими кислотами. Метод основан на способности органических кислот нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка.

Ход определения. В две пробирки наливают по 10 капель раствора яичного белка. Добавляют в одну из них 2 капли трихлоруксусной кислоты, а в другую – 2 капли хлорной кислоты, отмечают произошедшие изменения.

в. Денатурация белка солями тяжелых металлов. Метод основан на связывании ионов тяжелых металлов с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекулу белка, в результате чего разрушается ее пространственная структура и происходит осаждение денатурированного белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме AgNO₃ и HgCl₂) происходит растворение первоначально образующегося осадка из-за адсорбции иона металла и приобретении вследствие этого белковой молекулой положительного заряда.

Ход определения. В две пробирки вносят по 10 капель раствора яичного белка. В первую из них добавляют 1-2 капли раствора сульфата меди, а во вторую – 1-2 капли раствора ацетат свинца. Наблюдают за выпадением осадка белка. Прибавляют в каждую из пробирок по несколько капель соответствующего осадителя и наблюдают за растворением осадка.

г. Денатурация белка органическими растворителями. Метод основан на способности органических растворителей (спирт, хлороформ) нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка.

Ход определения. В три пробирки наливают по 10 капель раствора белка и добавляют равные объемы органических растворителей: в первую – этиловый спирт, во вторую – ацетон, в третью – хлороформ. Наблюдают за выпадением белка.

Оформление работы. Особенности действия денатурирующих веществ указать в протоколах по каждой реакции осаждения. В выводах отметить причину денатурации белка.

Практическое значение работы. Явление денатурации белков используется в клинике, фармации и биохимических исследованиях:

а) для осаждения белка в изучаемом биологическом материале с целью дальнейшего определения в нем низкомолекулярных субстратов;

б) для выявления присутствия белка в различных биологических экстрактах и жидкостях и количественного его анализа (в частности, качественное и количественное определение белка в моче основано на реакции денатурации белка азотной кислотой);

в) для связывания солей тяжелых металлов белком при лечении отравлений или их профилактике на производстве;

г) для обеззараживания отходов в санитарно практике;

д) для дезинфекции кожи и слизистых покровов.

Высаливание – процесс осаждения белков солями щелочных и щелочно-земельных металлов, который является обратимым и сохраняет нативные свойства белков. Высаливание можно проводить не только солями щелочных и щелочно-земельных металлов (Na₂SO₄, NaCl, KCl, MgSO₄, MgCl₂ и др.), но и нейтральными солями, например (NH₄)₂SO₄. Все вещества этого типа нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к осаждению белка. При растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных физико-химических и биологических свойств.

Белки отличаются друг от друга зарядом и гидрофильностью, поэтому можно разделить белки, используя для их осаждения разные концентрации солей или органических растворителей в среде.

Реактивы. Сульфат аммония, насыщенный раствор; сульфат аммония, кристаллический, тонко измельченный; биуретовый реактив^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки; воронки для фильтрования; бумажные фильтры.

Метод основан на способности сульфата аммония нейтрализовывать заряд молекул белков и вызывать их дегидратацию, что приводит к осаждению белка (высаливанию); при полунасыщении осаждаются глобулины, а при полном насыщении – альбумины сыворотки крови. Это связано с тем, что глобулины менее гидрофильны и имеют большую молекулярную массу, чем альбумины.

Ход определения. В пробирку вносят 20 капель сыворотки крови и добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония (получается полунасыщенный раствор). Выпадает осадок глобулинов. Через 5 мин осадок отфильтровывают.

К фильтрату прибавляют тонко измельченный порошок сульфата аммония до тех пор, пока он не перестает растворяться (полное насыщение). Выпадает осадок альбуминов. Осадок отфильтровывают. Фильтрат проверяют на отсутствие белка, проделывая биуретовую реакцию (см. работу 1).

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы:

В выводе указать на возможность разделения белков методом высаливания, принцип его и отличия от осаждения путем денатурации.

Практическое значение работы. Метод высаливания используют в клинических лабораториях для разделения альбуминов и глобулинов и определения их соотношения в сыворотке крови. Осажденную фракцию белка можно отделить центрифугированием, растворить и количественно определить содержание ее с помощью различных методов. В норме соотношение альбумин/глобулин в сыворотке крови человека колеблется в пределах 1,5-2,3 и может меняться при патологии, например, при воспалительных заболеваниях, когда увеличивается содержание глобулинов.

Высаливание применяют также для очистки и получения кристаллических препаратов белков.

Конфликты в семейной жизни. Как это изменить? Редкий брак и взаимоотношения существуют без конфликтов и напряженности. Через это проходят все...

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Что будет с Землей, если ось ее сместится на 6666 км? Что будет с Землей? - задался я вопросом...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: