|
|
Работа 3. Хроматографический метод разделения аминокислот
Хроматография – один из эффективных и широко применяемых в биохимических исследованиях методов разделения аминокислот. Наиболее простой и доступной является распределительная хроматография на бумаге. Для проведения ее используют систему растворителей, составляющих подвижную и неподвижную фазы, от правильного подбора которых зависит эффективность разделения аминокислот. В частности, применяют фенол, насыщенный водой. При обработке хроматографической бумаги этой смесью растворителей вода с небольшим количеством фенола впитывается в бумагу и образует неподвижную фазу, а фенол, насыщенный водой, служит подвижной фазой. В зависимости от направления фронта передвижения растворителя различают следующие виды хроматографии: восходящую, нисходящую, одномерную, двухмерную и радиальную. Расположение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления хроматограмм. Для этого высушенную бумагу обрабатывают раствором нингидрина и затем нагревают ее в сушильном шкафу при 100°С, т.е. проводится качественная нингидриновая реакция на аминокислоты, находящиеся на бумаге. Скорость перемещения аминокислот выражают коэффициентом Rf, который представляет собой отношение расстояния, пройденного данной аминокислотой, к пути, пройденному фронтом растворителя:
Rf = a/b,
где a – расстояние от места нанесения раствора смеси аминокислот (линия старта) до центра пятна конкретной аминокислоты; b – путь, пройденный растворителем от линии старта до его фронта окончания хроматографии, мм. Для каждой аминокислоты характерно свое значение Rf, которое зависит от сорта хроматографической бумаги, системы растворителей, температуры, рН среды и т.д. Реактивы. Фенол, насыщенный водой*; нингидрин, 0,2%-ный раствор в ацетоне. Оборудование. Термостат, отрегулированный на температуру 37-38°С; сушильный шкаф, отрегулированный на температуру 100-105°С и имеющий перекладины с крючками для подвешивания хроматограмм; большие пробирки (диаметр 2,0-2,5 см, длина 18-20 см) с плотно подогнанными пробками и штатив для них; полоски хроматографической бумаги (ленинградская, лучше марки «быстрая», 12х150 мм); простой карандаш и линейка; игла с ниткой; микропипетка; чашка Петри или пульверизатор; пинцет; ножницы; пипетка вместимостью 5 мл. Материалы. Раствор смеси L-аланина, лейцина и глутаминовой кислоты, 0,04 моль/л.
Метод основан на разной скорости передвижения аминокислот по бумаге в зависимости от коэффициента распределения их между неподвижной (вода с примесью фенола) и подвижной (фенол, насыщенный водой) фазами растворителя. Ход определения. Берут пинцетом за конец полоску бумаги (не касаться бумаги пальцами!), прокалывают его иглой с ниткой, которую завязывают петлей длиной 5-6 см. На противоположном конце полоски, отступив от края 2 см, проводят простым карандашом линию старта и в центре ее очерчивают кружок диаметром 3-4 мм для нанесения раствора смеси аминокислот. Полоску укладывают на лежащие стеклянные пробирки и наносят 0,2 мл раствора смеси аминокислот, но не сразу, а порциями. После нанесения каждой порции пятно подсушивают, чтобы оно не расплывалось за пределы очерченного карандашом кружка. В сухую пробирку с помощью пипетки вносят 2 мл фенола, насыщенного водой (при работе с фенолом соблюдать осторожность: вызывает ожоги! Не насасывать его в пипетку ртом!), следя за тем, чтобы не смочить стенки пробирки. Ставят пробирку в штатив строго вертикально. Осторожно, держа за нитку, опускают в пробирку полоску бумаги, погружая ее нижний конец в растворитель не более чем на 2-3 мм, и закрепляют ее в висячем положении, прижав петлю плотно закрытой пробкой (рис.4). Помещают штатив с пробиркой в термостат (при 37-38°С) на 1,5 ч.
Рис. 4. Прибор для хроматографии (а) и хроматограмма аминокислот (б)
Затем вынимают полоску, подвешивают ее за петлю в сушильном шкафу и выдерживают при 100-105°С в течение 10 мин. Для проявления хроматограммы полоску переносят в чашку Петри, в которую налито 15 мл раствора нингидрина, держа ее пинцетом, проводят через раствор и вновь помещают в сушильный шкаф на 5 мин при той же температуре. Оформление работы. Зарисовать в рабочем состоянии прибор, отметив положение аминокислот на хроматограмме. Измерить линейкой расстояния (в мм) a и b для каждой аминокислоты и рассчитать их Rf. В выводе отметить возможность разделения хроматографией на бумаге разных аминокислот. Практическое значение работы. Хроматографический анализ свободных аминокислот в сыворотке крови, моче и других жидких средах применяется в клинике для диагностики наследственных заболеваний обмена аминокислот, патологии печени, почек, а также при оценке степени тяжести сахарного диабета: в фармации – для контроля качества белковых гидролизатов и препаратов смеси аминокислот, а в научных экспериментах – для изучения аминокислотного состава гидролизатов очищенных белков.
  ЧТО ПРОИСХОДИТ ВО ВЗРОСЛОЙ ЖИЗНИ? Если вы все еще «неправильно» связаны с матерью, вы избегаете отделения и независимого взрослого существования...  Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...  ЧТО ПРОИСХОДИТ, КОГДА МЫ ССОРИМСЯ Не понимая различий, существующих между мужчинами и женщинами, очень легко довести дело до ссоры...  Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор... Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:
|
