ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЧЕСКИЙ ПРАКТИКУМ

Биохимические исследования проводятся для получения информации о многочисленных химических и физикохимических процессах, протекающих в клетках и тканях живых организмов в норме и при патологии. В зависимости от цели исследования используются специальные приемы обработки биологического материала и соответствующие физикохимические методы, которыми студенты овладевают при выполнении биохимического практикума. Однако прежде чем приступить к изучению конкретных методик исследования, необходимо познакомиться с некоторыми общими положениями и приемами практической биохимии.

Основные методы разделения и выделения веществ

Гомогенаты представляют собой сложную смесь частиц, отличающихся по размеру, форме и химическому составу. Для разделения и выделения этих частиц, а также молекул, содержащихся в биологическом материале, используются различные методы, которые суммированы в табл.1.

Таблица 1. Основные методы разделения и выделения веществ, применяемые при биохимических исследованиях

Основные приборы, используемые в практикуме

При проведении биохимических исследований используются различные приборы и оборудование, позволяющие выделить изучаемое вещество и определить его содержание в биологическом материале.

Фотометрия (абсорбциометрия) – метод качественного и количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веществом светового потока.

Светопоглощение или экстинкция, согласно закону фотометрии Ламберта-Бугера-Бера прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту экстинкции (Е). Последний представляет собой поглощение раствора вещества концентрацией 1моль/л, помещенного в кювету с толщиной слоя 1см, и измеряется в л·моль^-1·см^-1.

Рис. 1. Общий вид колориметра фотоэлектрического концентрационного

1 – гальваномер; 2 – крышка кюветного отделения; 3 – ручка установки «грубо»;

4 – ручка установки «точно»; 5 – ручка чувствительности; 6 – ручка кюветодержателя; 7 – переключатель светофильров.

Часто используют и другой показатель – удельный коэффициент экстинкции Е_1см^1%, т.е. поглощение света 1%-ным раствором вещества в кювете с толщиной слоя 1см. Для определения содержания какого-либо компонента биологического материала строят калибровочный график, отражающий зависимость между экстинкцией (Е) и концентрацией (С) этого вещества в растворе и представляющий собой прямую линию в прямоугольной системе координат.

Для фотометрического анализа используют фотоэлектроколориметры, фотоэлектроколориметры-нефелометры и спектрофотометры.

Фотоэлектроколориметры (ФЭК) различных моделей применяют для анализа светопоглощения окрашенных растворов веществ в видимой области спектра (рис.1).

Фотоэлектроколориметры-нефелометры применяют для измерения интенсивности светорассеивания или ослабления светового потока изучаемых веществ в мутных средах.

Колориметр фотоэлектрический концентрационный позволяет благодаря большому набору узкополосных светофильтров проводить измерения в определенной области спектра в диапазоне длин волн 315-980 нм. Этот прибор используют для определения светопоглощения веществ, а также коэффициент пропускания рассеивающих взвесей, эмульсий и коллоидных растворов в проходящем свете. Порядок работы изложен в инструкции.

Спектрофотометры (рис.2) используют для изучения строения, качественного и количественного анализа вещества по интенсивности поглощения его в монохроматическом свете. В клинико-биохимических и научных исследованиях широко применяются спектрофотометры СФ-16, СФ-26, СФ-46 и их современные модификации, работающие в области спектра от 186 до 1100 нм.

Правила работы на спектрофотометре изложены в инструкциях к прибору.

Для качественного и количественного анализа веществ, которые, поглощая энергию, способны к люминисценции (флуоресценции) применяются флуороскопы и флуориметры.

Флуороскоп позволяет проводить полуколичественный анализ путем визуального сравнения интенсивности флуоресценции опытного раствора со стандартным, где концентрация вещества известна.

Флуориметры позволяют проводить количественный анализ. В этих приборах выделение области спектра, необходимого для возбуждения данного вещества, осуществляется первичными светофильтрами, а пропускание характерного для него участка излучения (свечения) – с помощью вторичных светофильтров.

Центрифугирование – метод разделения смеси компонентов жидких сред под действием центробежной силы. Его используют для отделения форменных элементов крови от плазмы, для осаждения и выделения клеток из мочи, спинно-мозговой жидкости и других сред организма, а также для отделения осадков от жидкой фазы (надосадочная жидкость, или супернатант). В клинико-биохимических лабораториях для этой цели используют малогабаритные центрифуги общего назначения. Они дают максимальную скорость около 6000 об·мин^-1.

Для специальных биохимических исследований применяют ультрацентрифуги с охлаждением (рефрижераторные), например ЦР-2-25, УЦП-1-75 и др. Они позволяют проводить дифференциальное центрифугирование, т.е. разделение частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью.

Скорость осаждения частиц определяется центробежным ускорением, которое обычно выражают в единицах g (гравитационная постоянная, равная 980 см·с^-2). Величину g обозначают как относительное центробежное ускорение. Она зависит от скорости вращения ротора (п, об·мин^-1) и расстояния (r, см) от оси вращения ротора до середины столбика жидкости в пробирке и определяется по формуле

На практике g устанавливают по номограмме, прилагаемой к инструкции для каждой ультрацентрифуги. С помощью дифференциального центрифугирования выделяют субклеточные частицы – ядра, митохондрии, лизосомы, микросомы и др.

Электрофорез – метод разделения заряженных частиц под действием внешнего электрического поля. Электрофорез проводят в специальных аппаратах разной конструкции (рис.3). Поддерживающий материал располагается в них на лотках, специальных кюветах, стеклянных трубочках, стеклах и может находиться в горизонтальном (горизонтальный электрофорез) или вертикальном (вертикальный электрофорез) положении. Для электрофоретического разделения используют пористый поддерживающий материал (фильтровальная бумага, ацетилцеллюлоза), различные гели (агар, крахмал, полиакриламид, декстран) и т.д. Перед помещением в камеру аппарата для электрофореза бумагу смачивают буферным раствором, а гель заранее готовят на нем. Смесь веществ, наносимая микропипетками на горизонтально расположенный материал или на столбик геля, разделяется при электрофорезе на фракции. Условия электрофореза зависят от целей разделения и подбираются заранее.

Рис. 3. Прибор (а) и камера (б) для электрофореза:

1 – верхняя камера; 2 – нижняя камера; 3 – уплотнительные кольца;

Электрофореграммы фиксируют, окрашивают специальными красителями для выявления локализации на них разделенных веществ. Если вещество флуоресцирует, то его положение устанавливают при просмотре фореграммы в ультрафиолетовом свете. Количественное определение производят по содержанию красителя, связавшегося с разными фракциями веществ на электрофореграмме, или путем прямого измерения светопоглощения этих зон на специальных приборах – денситометрах.

4. Применение единиц СИ для выражения результатов

В биохимии и клинической химии используются основные и производные единицы СИ.

Основные единицы СИ. К основным единицам относятся семь единиц СИ: метр, килограмм, секунда, моль, ампер, кельвин и кандела (табл.2).

Первые четыре из них широко применяются в клинической химии.

Производные единицы СИ представляют собой сочетание основных единиц (табл.3). Например, производной единицей является скорость химической (ферментативной) реакции. Так, активность фермента выражается в единицах количества вещества, превращенного (имеется в виду убыль субстрата или накопление продукта реакции) в единицу времени.

Кратные и дольные значения единиц СИ. Довольно часто выражение результатов клинико-биохимических исследований в единицах СИ оказывается неудобным, потому что получаемые значения бывают либо очень малы, либо велики. Для этого система СИ предусматривает использование кратных и дольных значений единиц СИ. Их названия образуют от исходных названий единиц СИ, добавляя к ним соответствующие приставки (табл.4). Например, одна тысячная доля моля (10^-3 моль) называется миллимоль и обозначается ммоль.

Единицы, допустимые к применению наравне с единицами СИ. Некоторые единицы хотя и не относятся к единицам СИ, но используются наравне с ними. Из них для выражения результатов биохимических исследований особенно важны единица объема – литр (л) и единицы времени – минута (мин), час (ч), сутки (сут), которые используются при выражении результатов биохимических исследований.

Таблица 4. Множители и приставки, применяемые для обозначения

Белки – высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, состоящие из аминокислот, соединенных пептидными связями, и имеющие сложную структурную организацию.

Белки делятся на две группы: простые, или протеины, и сложные, или протеиды. Протеины состоят только из аминокислот, связанных в полипептидную цепь пептидными связями, а протеиды содержат кроме аминокислот небелковый компонент, или простетическую группу (углевод, липид, нуклеиновую кислоту, кофактор и т.д.). Белки имеют несколько уровней структурной организации: первичный, вторичный, третичный и в большинстве случаев четвертичный.

Через час после начала диализа берут две пробы (по 10 капель) наружной жидкости (диализат). С одной стороны из них проводят биуретовую реакцию на белок, а с другой – реакцию на сульфаты, добавляя 2-3 капли хлорида бария.

Проделывают пробы на белок и сульфаты с жидкостью внутри мешочка.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы, отметив знаками «плюс» или «минус» наличие реакции:

В выводах отметить, какое свойство белка демонстрирует метод диализа и возможность его применения.

Практическое значение работы. Метод анализа используется для отделения низкомолекулярных органических примесей и неорганических ионов при очистке белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.д. в биохимических исследованиях или при получении лечебных препаратов (например, белковых). Способ диализа положен в основу работы аппарата «искусственная почка», который применяется для очищения крови от природных низкомолекулярных «шлаков» и токсических соединений.

При гидролизе нуклеопротеиды и нуклеиновые кислоты распадаются на составные части. Обнаружение и методы количественного определения нуклеиновых кислот и их мономеров (нуклеотидов) в биологическом материале и препаратах основаны на особенностях химической природы этих соединений.

Реактивы. Нитрат серебра, 2%-ный аммиачный раствор^*; раствор аммиака, конц.; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор; молибдат аммония, раствор в азотной кислоте^*; орциновый реактив^*; дифениламиновый реактив^*.

Оборудование. Глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 мл; штатив с пробирками; водяная баня.

1. Гидролизат дезоксирибонуклеопротеида (см. работу 13, г).

2. Лекарственные препараты нуклеотидной природы: фосфаден (аденозинмонофосфат), 2%-ный раствор в ампулах, и аденозинтрифосфат натрия, 1%-ный раствор в ампулах.

Ход определения. В пробирку вносят 10 капель гидролизата, помещают в него кусочек лакмусовой бумаги и приливают по каплям примерно 10 капель концентрированного раствора аммиака до щелочной реакции по лакмусу. Добавляют 10 капель аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии образуется осадок с характерной окраской.

б. Дифениламиновая проба на пентозы. Принцип метода см. работу 13, б.

Ход определения. Для определения берут 5 капель гидролизата и проделывают реакцию, как описано в работе 13, б.

в. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. Принцип метода см. работу 11.

Ход определения. Берут 10 капель гидролизата и проделывают реакцию, как описано в работе 11.

г. Качественные реакции на лекарственные препараты нуклеотидной природы. Метод основан на обнаружении рибозы в препаратах нуклеотидной природы с помощью дифениламиновой реакции и пробы с орциновым реактивом. Последняя состоит в том, что фурфурол, образующийся из рибозы при нагревании в среде с соляной кислотой, дает с орцином окрашенное соединение зеленого цвета.

Ход определения. В две пробирки добавляют по 5 капель соответственно раствора фосфадена и аденозинтрифосфата натрия. К ним приливают по 10 капель дифениламинового реактива, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане. Отмечают результат реакции.

В две другие пробирки вносят по 5 капель тех же веществ и добавляют по 5 капель орцинового реактива. Нагревают в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Отмечают результат реакции.

Оформление работы. По результатам работы сделать вывод о возможности использования реакции для обнаружения компонентов нуклеиновых кислот и нуклеотидов и их применения в практике. Данные оформить в виде таблицы.

Практическое значение работы. Реакции на компоненты нуклеиновых кислот и нуклеотиды могут применяться для их идентификации и количественного анализа в биохимических исследованиях, а в фармации – для контроля качества препаратов нуклеотидной и нуклеозидной природы.

Для количественного определения нуклеиновых кислот используют методы, основанные на регистрации их светопоглощения или на специфических реакциях на отдельные компоненты этих соединений. Нуклеиновые кислоты имеют максимум поглощения света при 260 нм, который обусловлен присутствием в них азотистых оснований. Все основания полинуклеотидов обладают тем же максимумом абсорбции, за исключением цитозина, зона наибольшего поглощения которого находится при 270 нм. Поэтому по интенсивности светопоглощения азотистых оснований нуклеотидов можно определить содержание нуклеиновой кислоты в экстрактах из биологического материала или растворах. Однако светопоглощение природной ДНК на 40-50% ниже, чем составляющих ее нуклеотидов. Этот так называемый «гипохромный эффект» связан с двуспиральной структурой природной ДНК. Гипохромный эффект характерен также и для РНК, содержащих спиральные участки или петли.

Учитывая эти особенности нуклеиновых кислот, А.С.Спирин разработал метод измерения светопоглощения гидрализатов ДНК и РНК при двух длинах волн – 270 и 290 нм, поскольку при этих условиях на определение концентрации нуклеиновых кислот практически не влияют различия в их нуклеотидном составе.

Количество нуклеиновых кислот в пробах можно измерить, используя реакции на пентозы с дифениламином и орцином. Однако следует учитывать, что при кислотном гидролизе ДНК разрушается N-гликозидная связь в пуриннуклеотидах, но не в пиримидиннуклеотидах. Поэтому только часть дезоксирибозы становится реакционноспособной, причем величина ее определяется нуклеотидным составом (отношением пуринов к пиримидинам) ДНК.

Практическое значение работ по количественному определению нуклеиновых кислот. Количественное определение нуклеиновых кислот, выделяемых при биохимических исследованиях тканей и клеток, можно проводить прямой спектрофотометрией в ультрафиолетовой области или с помощью специфических реакций на пентозы: дифениламиновой – на дезоксирибозу, а с орциновой – на рибозу. Эти же методы можно использовать и при хроматографическом разделении пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов или нуклеотидов. Количественные методы определения нуклеиновых кислот применяются в экспериментальной и клинической биохимии, а также для количественного анализа лекарственных средств нуклеотидной или нуклеозидной природы в контрольно-аналитических лабораториях.

Липиды – разнородная по химическому строению группа органических веществ биологического происхождения, практически нерастворимых в воде и легко растворимых в органических неполярных (хлороформ, эфир, бензол, дихлорэтан и др.) и полярных (этанол, метанол, ацетон и др.) жидкостях. Разнообразие химического строения липидов затрудняет их классификацию. Эту группу веществ можно разделить на липидные мономеры (жирные кислоты, высшие алифатические и аминоспирты и др.), простые липиды (ацилглицерины, воска, диольные липиды), сложные липиды (фосфолипиды и гликолипиды) и стероиды (наиболее распространенный из них – холестерин и его эфиры). Биологические функции липидов в живых организмах многообразны. Они содержатся в жидких средах и входят в состав биологических мембран клеток организма. Ввиду плохой растворимости в воде липиды образуют соединения с гидрофильными молекулами – белками, углеводами. Образование липид-белковых комплексов (липопротеидов) придает липидам растворимость в воде и позволяет транспортироваться с кровью и лимфой в организме. Своеобразие растворимости используется при исследовании липидов, поскольку позволяет отделить их от других веществ, которые находятся в биологическом материале. Поэтому подбор растворителей в ходе извлечения липидов из образцов имеет большое значение при их анализе.

Для обнаружения и количественного определения отдельных представителей липидов, экстрагированных из биологического материала, существуют различные физико-химические методы и реакции на функциональные группы. Анализ липидов проводят путем постановки специфических реакций на составные части в целой молекуле или после ее гидролиза.

Ферменты (энзимы) – биологические катализаторы белковой природы. Они содержатся во всех тканях, клетках, внутриклеточных органоидах и биологических жидкостях. Без них не осуществляется ни один химический процесс в организме. Разработка методов выделения и очистки ферментов дала возможность получить их в чистом и кристаллическом виде. Это позволило изучить структуру ферментов, активные и регуляторные центры их молекул, механизм действия, роль простетических групп в катализе и т.д. Как любые белки, ферменты подвержены денатурации, поэтому процедура их получения из биологического материала (ткани животных и растений, микроорганизмы, жидкости) должна быть щадящей, т.е. вестись при температуре 0-4˚С, при рН 5-9 (за исключением особых случаев). Среда для извлечения ферментов не должна содержать примесей тяжелых металлов, которые инактивируют ферменты.

Ферменты делятся на простые и сложные. У простых ферментов функцию контактного и каталитического участков активного центра выполняют только радикалы аминокислот; у сложных – в состав активного центра входят также коферменты и ионы металлов. Сложные ферменты без кофакторов не активны, что нужно учитывать при их идентификации.

Таблица 6. Проба с иодом на крахмал и продукты его гидролиза

Чем выше скорость катализа, тем быстрее исчезает (положительная иод-крахмальная проба) синее окрашивание и усиливается реакция Фелинга на мальтозу.

Ход определения. Берут три пробирки: в первую вносят 1 мл воды, во вторую – 1 мл раствора соляной кислоты, в третью – 1 мл разбавленной слюны. Добавляют во все пробы по 5 мл раствора крахмала, перемешивают их стеклянной палочкой и ставят первую и третью пробирки в водяную баню при 38˚С, а вторую – в кипящую водяную баню. Через 15 мин пробирки охлаждают. Из каждой пробирки отбирают по 5 капель в другие пробирки, добавляют по 1-2 капли раствора иода и сравнивают окрашивание проб.

Для определения мальтозы отбирают по 3 мл из каждой пробирки, прибавляют по 1 мл реактива Фелинга и нагревают верхний слой смеси до кипения. Отмечают появление в пробах красного осадка оксида меди (I).

Оформление работы. Результаты заносят в таблицу.

В выводах указать разницу в действии катализаторов на скорость гидролиза крахмала.

Реактивы. Субстратная смесь для выявления глюкозофосфат-изомеразы^*, трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; резорцин, 0,1%-ный раствор в 3,6%-ной соляной кислоте; соляная кислота, 36%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторный термометр.

Метод основан на определении фруктозо-6-фосфата, образующегося в ходе изомеризации глюкозо-6-фосфата под действием глюкозофосфат-изомеразы:

Фруктозо-6-фосфат образует с резорцином в присутствии соляной кислоты соединение красного цвета.

Ход определения. В две пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки крови. В одну из них (опытную) добавляют 1 мл субстратной смеси и перемешивают. Помещают обе пробирки на 30 мин в водяную баню при 37˚С, а по окончании инкубации в них приливают по 1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (для остановки реакции). В контрольную пробу доливают 1 мл субстратной смеси.

После перемешивания содержимое каждой пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Отбирают по 1 мл фильтрата в чистые пробирки, приливают по 1 мл резорцина и по 3 мл раствора соляной кислоты. Смеси энергично встряхивают и оставляют для развития окраски. Отмечают разницу окрашивания в пробах.

Оформление работы. Отметить различие окраски проб и сделать вывод о присутствии фермента в сыворотке крови.

Реактивы. Малоновая кислота, 1%-ный раствор, нейтрализованный NaOH; сукцинат натрия, 1%-ный раствор; метиленовый синий, 1%-ный раствор; вазелиновое масло.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня; лабораторный термометр.

Материал. Мышечная кашица, полученная после забоя животного.

Метод основан на сравнительном определении активности сукцинатдегидрогеназы по обесцвечиванию в ходе реакции метиленовой сини (МС) как акцептора водорода в присутствии и в отсутствии малоновой кислоты.

Образующийся ФАД∙Н₂ восстанавливает метиленовую синь (МС∙Н₂), в результате чего происходит обесцвечивание раствора. Сравнивая визуально уменьшение интенсивности синего окрашивания с пробами, содержащими разные количества малоновой кислоты (НООС – СН₂ – СООН), делают вывод о типе действия ее на фермент.

Ход определения. В три пробирки помещают по 3-4 г мышечной кашицы и добавляют в первую пробирку 0,8 мл воды, во вторую 0,2 мл раствора малоновой кислоты и 0,6 мл воды, а в третью – 0,8 мл раствора малоновой кислоты.

Во все пробирки приливают по 1 мл раствора сукцината натрия, по 1 капле раствора метиленового синего и после перемешивания по 3-4 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню при 37˚С. Через 3-5 мин наблюдают обесцвечивание раствора.

Оформление работы. Сравнить интенсивность голубого окрашивания в трех пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Практическое значение работы. Конкурентные ингибиторы различных ферментов широко применяются в биохимических исследованиях и в практической медицине как лекарственные препараты. В частности, малоновая кислота как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы используется в экспериментах на животных для того, чтобы изучить изменения в обмене веществ в тканях при блокаде этого фермента, а также для исследования самого механизма конкурентного торможения.

Изоферменты отличаются друг от друга несколькими физико-химическими признаками и, в частности, зарядом молекул, поэтому электрофорез издавна используется для их разделения. Изоферменты лактатдегидрогеназы были открыты одними из первых.

Различают пять типов изоферментов ЛДГ, которые в порядке подвижности к аноду обозначаются: ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Каждый из них представляет собой тетрамер, отличающийся составом субъединиц (см. учебник, с.226, 438).

Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы

Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.

Реактивы. Раствор № 1 для полимеризации геля с рН 8,9 (1,0 М соляная кислота – 48 мл, трис-основание – 36,6 г, N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин, или ТЕМЕД – 0,23 мл и дистиллированная вода до 100 мл); раствор № 2 (акриламид – 30,0 г, N,N-метиленбисакриламид – 0,8 г и дистиллированная вода до 100 мл); персульфат аммония, 0,14%-ный свежеприготовленный раствор; сахароза, 40%-ный раствор; электродный буфер с рН 8,9 (трис-основание – 6,0 г, глицин – 28,8 г, дистиллированная вода до 1 л; перед употреблением разводят в 10 раз); уксусная кислота, 7%-ный раствор; фосфатный буфер, 0,5 М с рН 7,4; лактат натрия, 1 М раствор; НАД, 10 г/л раствор; нитротетразолиевый синий (НС), 1 г/л раствор; феназинметасульфат (ФМС), 1 г/л раствор; хлорид магния, 0,005 М раствор; хлорид натрия, 0,1 М раствор.

Оборудование. Колба коническая вместимостью 25 мл; пипетки с оттянутым тонким концом; фильтровальная бумага; стеклянные палочки; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,5 и 10 мл; резиновые колпачки; аппарат для электрофореза со стеклянными трубочками; источник постоянного напряжения; микроденситометр; спектрофотометр или ФЭК.

Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана.

Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов № 1, № 2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. Смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

ЧТО И КАК ПИСАЛИ О МОДЕ В ЖУРНАЛАХ НАЧАЛА XX ВЕКА Первый номер журнала «Аполлон» за 1909 г. начинался, по сути, с программного заявления редакции журнала...

Система охраняемых территорий в США Изучение особо охраняемых природных территорий(ООПТ) США представляет особый интерес по многим причинам...

Что делать, если нет взаимности? А теперь спустимся с небес на землю. Приземлились? Продолжаем разговор...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: