Сдам Сам

ПОЛЕЗНОЕ


КАТЕГОРИИ







Основные методы разделения и выделения веществ





При биохимиеских иследованиях

 

Гомогенаты представляют собой сложную смесь частиц, отличающихся по размеру, форме и химическому составу. Для разделения и выделения этих частиц, а также молекул, содержащихся в биологическом материале, используются различные методы, которые суммированы в табл.1.

 

 

Таблица 1. Основные методы разделения и выделения веществ, применяемые при биохимических исследованиях

(по В.В.Меньшикову, с дополнениями)

 

Свойство, используемое для разделения Методы разделения и выделения
Различие температур перехода 1.Перегонка (дистилляция)
веществ из одного состояния в другое 2.Микродиффузия (изотермическая дистилляция)
  3.Озоление
  4.Выпаривание (высушивание)
  5.Лиофилизация
Различие растворимости веществ 6.Экстракция
  7.Противоточное распределение
  8.Фракционное осаждение (по видам осаждающих агентов и средств):
  8.1.Нейтральными солями (высаливание)
  8.2.Кислотами
  8.3.Гидрофильными органическими растворителями
  8.4.Водорастворимыми недиссоциирующими высокомолекулярными полимерами
  8.5.Тяжелыми металлами и их гидроксидами
  8.6.Органическими катионами
  8.7.Анионами и полианионами
  8.8.Иммунопреципитацией
Различие скорости седиментации 9.Седиментационный анализ:
(осаждения) 9.1.Центрифугирование
  9.2.Ультрацентрифугирование
Различие в размерах молекул 10.Диализ:
  10.1.При равном давлении
  10.2.При повышенном давлении
  10.3.При пониженном давлении (ультрафильтрация)
  10.4.Электродиализ
Различие распределения между подвижной и неподвижной фазами, основанное на неодинаковой растворимости, сорбируемости, 11.Хроматография (по технике осуществления подразделяется на колоночную, тонкослойную и бумажную):
на разнице в значениях электрического заряда, в размерах молекул 11.1.Адсорбционная (жидкостно-адсорбционная, ионообменная, газо-адсорбционная)
11.2.Распределительная (жидкостно-жидкостная, газо-жидкостная)
11.3.Гель-хроматография и гель-фильтрация
11.4.Аффинная (биоспецифическая) хроматография
Различие в электрическом заряде молекул 12.Электрофорез:
12.1.Свободный
12.2.На носителях: а) на бумаге (простой и высоковольтный) б) на гелях (агар, агароза, крахмал, полиакриламид) в) на пленке (ацетилцеллюлоза)
13.Комбинированный электрофорез:
13.1.Электрофорез+иммунодиффузия (иммуноэлектрофорез)
13.2.Электрофорез+хроматография (техника «отпечатков пальцев»)
Различие в электрическом заряде молекул при определенном рН 14.Изоэлектрическое фокусирование в градиенте рН:
14.1.Свободное
14.2.Зональное
14.3.В геле
14.4.Иммуноэлектрофокусирование

 



 

Основные приборы, используемые в практикуме

 

При проведении биохимических исследований используются различные приборы и оборудование, позволяющие выделить изучаемое вещество и определить его содержание в биологическом материале.

Фотометрические приборы

Фотометрия (абсорбциометрия) – метод качественного и количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веществом светового потока.

Светопоглощение или экстинкция, согласно закону фотометрии Ламберта-Бугера-Бера прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту экстинкции (Е). Последний представляет собой поглощение раствора вещества концентрацией 1моль/л, помещенного в кювету с толщиной слоя 1см, и измеряется в л·моль-1·см-1.

 
 

Рис. 1. Общий вид колориметра фотоэлектрического концентрационного

1 – гальваномер; 2 – крышка кюветного отделения; 3 – ручка установки «грубо»;

4 – ручка установки «точно»; 5 – ручка чувствительности; 6 – ручка кюветодержателя; 7 – переключатель светофильров.

 

Часто используют и другой показатель – удельный коэффициент экстинкции Е1см1%, т.е. поглощение света 1%-ным раствором вещества в кювете с толщиной слоя 1см. Для определения содержания какого-либо компонента биологического материала строят калибровочный график, отражающий зависимость между экстинкцией (Е) и концентрацией (С) этого вещества в растворе и представляющий собой прямую линию в прямоугольной системе координат.

Для фотометрического анализа используют фотоэлектроколориметры, фотоэлектроколориметры-нефелометры и спектрофотометры.

Фотоэлектроколориметры (ФЭК) различных моделей применяют для анализа светопоглощения окрашенных растворов веществ в видимой области спектра (рис.1).

Фотоэлектроколориметры-нефелометры применяют для измерения интенсивности светорассеивания или ослабления светового потока изучаемых веществ в мутных средах.

Колориметр фотоэлектрический концентрационный позволяет благодаря большому набору узкополосных светофильтров проводить измерения в определенной области спектра в диапазоне длин волн 315-980 нм. Этот прибор используют для определения светопоглощения веществ, а также коэффициент пропускания рассеивающих взвесей, эмульсий и коллоидных растворов в проходящем свете. Порядок работы изложен в инструкции.

 

 
 

Рис. 2. Общий вид спектрофотометра.

 

Спектрофотометры (рис.2) используют для изучения строения, качественного и количественного анализа вещества по интенсивности поглощения его в монохроматическом свете. В клинико-биохимических и научных исследованиях широко применяются спектрофотометры СФ-16, СФ-26, СФ-46 и их современные модификации, работающие в области спектра от 186 до 1100 нм.

Правила работы на спектрофотометре изложены в инструкциях к прибору.

Флуориметрические приборы

Для качественного и количественного анализа веществ, которые, поглощая энергию, способны к люминисценции (флуоресценции) применяются флуороскопы и флуориметры.

Флуороскоп позволяет проводить полуколичественный анализ путем визуального сравнения интенсивности флуоресценции опытного раствора со стандартным, где концентрация вещества известна.

Флуориметры позволяют проводить количественный анализ. В этих приборах выделение области спектра, необходимого для возбуждения данного вещества, осуществляется первичными светофильтрами, а пропускание характерного для него участка излучения (свечения) – с помощью вторичных светофильтров.

 

Центрифуги

Центрифугирование – метод разделения смеси компонентов жидких сред под действием центробежной силы. Его используют для отделения форменных элементов крови от плазмы, для осаждения и выделения клеток из мочи, спинно-мозговой жидкости и других сред организма, а также для отделения осадков от жидкой фазы (надосадочная жидкость, или супернатант). В клинико-биохимических лабораториях для этой цели используют малогабаритные центрифуги общего назначения. Они дают максимальную скорость около 6000 об·мин-1.

Для специальных биохимических исследований применяют ультрацентрифуги с охлаждением (рефрижераторные), например ЦР-2-25, УЦП-1-75 и др. Они позволяют проводить дифференциальное центрифугирование, т.е. разделение частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью.

Скорость осаждения частиц определяется центробежным ускорением, которое обычно выражают в единицах g (гравитационная постоянная, равная 980 см·с-2). Величину g обозначают как относительное центробежное ускорение. Она зависит от скорости вращения ротора (п, об·мин-1) и расстояния (r, см) от оси вращения ротора до середины столбика жидкости в пробирке и определяется по формуле

g = 1,11∙10-5n2r

 

На практике g устанавливают по номограмме, прилагаемой к инструкции для каждой ультрацентрифуги. С помощью дифференциального центрифугирования выделяют субклеточные частицы – ядра, митохондрии, лизосомы, микросомы и др.

 

Приборы для электрофореза

Электрофорез – метод разделения заряженных частиц под действием внешнего электрического поля. Электрофорез проводят в специальных аппаратах разной конструкции (рис.3). Поддерживающий материал располагается в них на лотках, специальных кюветах, стеклянных трубочках, стеклах и может находиться в горизонтальном (горизонтальный электрофорез) или вертикальном (вертикальный электрофорез) положении. Для электрофоретического разделения используют пористый поддерживающий материал (фильтровальная бумага, ацетилцеллюлоза), различные гели (агар, крахмал, полиакриламид, декстран) и т.д. Перед помещением в камеру аппарата для электрофореза бумагу смачивают буферным раствором, а гель заранее готовят на нем. Смесь веществ, наносимая микропипетками на горизонтально расположенный материал или на столбик геля, разделяется при электрофорезе на фракции. Условия электрофореза зависят от целей разделения и подбираются заранее.

 

 
 

 

Рис. 3. Прибор (а) и камера (б) для электрофореза:

1 – верхняя камера; 2 – нижняя камера; 3 – уплотнительные кольца;

4 – трубочка с гелем; 5 – анод; 6 – катод.

 

Электрофореграммы фиксируют, окрашивают специальными красителями для выявления локализации на них разделенных веществ. Если вещество флуоресцирует, то его положение устанавливают при просмотре фореграммы в ультрафиолетовом свете. Количественное определение производят по содержанию красителя, связавшегося с разными фракциями веществ на электрофореграмме, или путем прямого измерения светопоглощения этих зон на специальных приборах – денситометрах.

 

 

4. Применение единиц СИ для выражения результатов

клинико-биохимических исследований

 

Общие положения

В биохимии и клинической химии используются основные и производные единицы СИ.

Основные единицы СИ. К основным единицам относятся семь единиц СИ: метр, килограмм, секунда, моль, ампер, кельвин и кандела (табл.2).

 

Таблица 2. Основные единицы СИ.

 

Величина Наименование единицы Обозначение единицы
Длина Метр м
Масса Килограмм кг
Время Секунда с
Количество вещества Моль моль
Термодинамическая температура Кельвин К
Сила света Кандела кд

 

Первые четыре из них широко применяются в клинической химии.

Производные единицы СИ представляют собой сочетание основных единиц (табл.3). Например, производной единицей является скорость химической (ферментативной) реакции. Так, активность фермента выражается в единицах количества вещества, превращенного (имеется в виду убыль субстрата или накопление продукта реакции) в единицу времени.

 

Таблица 3. Производные единицы СИ.

 

Величина Наименование единицы Обозначение единицы
Площадь Квадратный метр м2
Объем, вместимость Кубический метр м3
Давление (парциальное осмотическое) Паскаль Па
Плотность Килограмм на кубический метр кг/м3
Массовая концентрация компонента Килограмм на кубический метр кг/м3
Молярная концентрация компонента Моль на кубический метр моль/м3
Активность компонента Моль превращенного вещества в секунду моль/с
Скорость химической (ферментативной) реакции Моль превращенного вещества в секунду на кубический метр моль/(с·м3)

 

Кратные и дольные значения единиц СИ. Довольно часто выражение результатов клинико-биохимических исследований в единицах СИ оказывается неудобным, потому что получаемые значения бывают либо очень малы, либо велики. Для этого система СИ предусматривает использование кратных и дольных значений единиц СИ. Их названия образуют от исходных названий единиц СИ, добавляя к ним соответствующие приставки (табл.4). Например, одна тысячная доля моля (10-3 моль) называется миллимоль и обозначается ммоль.

Единицы, допустимые к применению наравне с единицами СИ. Некоторые единицы хотя и не относятся к единицам СИ, но используются наравне с ними. Из них для выражения результатов биохимических исследований особенно важны единица объема – литр (л) и единицы времени – минута (мин), час (ч), сутки (сут), которые используются при выражении результатов биохимических исследований.

 

Таблица 4. Множители и приставки, применяемые для обозначения

десятичных кратных и дольных единиц СИ.

 

Множитель Приставка Обозначение приставки (символ) Множитель Приставка Обозначение приставки (символ)
1012 гера Т 10-3 милли м
109 гига Г 10-6 микро мк
106 мега М 10-9 нано н
103 кило к 10-12 пико п
10-1 деци д 10-15 фемто ф
10-2 санти с      

 









Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:


©2015- 2019 zdamsam.ru Размещенные материалы защищены законодательством РФ.