Влияние рН среды на активность амилазы слюны

Каждый фермент проявляет максимум своего каталитического действия при строго определенном рН среды.

Реактивы: раствор слюны (свежую слюну разводят водой в 100 раз); 0,5 %-й раствор крахмала;0,1 М раствор лимонной кислоты;0,2 М раствор гидрофосфата натрия; раствор иода в иодиде калия (см. работу №11).

Оборудование: пробирки; водяная баня; пипетки.

Ход работы

1. В 7 пронумерованных пробирок налейте растворы лимонной кислоты и гидрофосфата натрия в количествах, указанных в табл., получая таким образом буферные смеси со значениями рН от 5.6 до 8,0.
2. В каждую пробирку добавьте 10 капель 1 %-го раствора хлорида натрия, 10 капель 0,5 %-го раствора крахмала и 10 капель раствора слюны.

1. Содержимое хорошо перемешайте и поставьте пробирки в водяную баню при температуре 37 – 38 ^оС.
2. Через 10 мин. пробирки быстро охладите и добавьте в каждую пробирку по капле раствора иода.
3. Содержимое пробирок перемешайте и сравните окраску полученных растворов.

Оформление результатов

Результаты исследования оформите, заполнив вышеприведенную таблицу. Установите, при каком рН произошло наиболее полное расщепление крахмала (желтая или буровато-желтая окраска с иодом).

ЛАБОРАТОРНАЯ работа №4

Определение активности каталазы

Каталаза – фермент, катализирующий реакцию расщепления пероксида водорода с образованием кислорода и воды. За ходом реакции можно следить по объему выделившегося кислорода.

Реактивы и материалы: растительный материал (листья или корни хрена, свежепророщенные семена или клубень картофеля); мел; 3 %-ный раствор пероксида водорода.

Оборудовани е: установка для сбора газа (рис.37); ступка с пестиком; стакан.

Рис.5. Газометрический прибор для определения активности каталазы. 1 – реакционная колба; 2 – зажим; 3 – бюретка с делениями; 4 – сосудик для раствора пероксида водорода; 5 – делительная воронка. Стеклянные части прибора соединены резиновой трубкой.

Ход работы

1. Растительный материал (0,5 г) разотрите в ступке с 20 см³ дистиллированной воды с добавлением небольшого количества мела (для создания слабощелочной среды). Оптимальное значение рН для каталазы составляет 7,7.

2. Гомогенат ткани оставьте на 5 – 10 мин. для отстаивания и затем полученный раствор перенесите в реакционную колбу (1).

1. В небольшой сосудик (4) влейте 5 см³ 3 %-го раствора пероксида водорода и осторожно пинцетом поставьте его внутрь реакционной колбы (1).
2. При открытом зажиме (2) осторожно плотно закройте реакционную колбу (1) пробкой газометрического прибора.
3. Закройте зажимом (2) сообщение с атмосферой и одновременно переверните сосудик (4) с перекисью внутри реакционной колбы (1). Пероксид смешивается с гомогенатом, содержащим каталазу, что вызовет разложение пероксида и выделение кислорода.
4. Выделяющийся кислород, попадая сверху в бюретку (3), будет отжимать воду вниз. По понижению уровня воды в бюретке судят об объеме выделившегося кислорода. Для того чтобы выровнять давление выделяющегося кислорода с атмосферным давлением, необходимо выровнять уровни воды в бюретке и воронке (5), опуская воронку (5) вниз.
5. Определите объем выделившегося кислорода через разные промежутки времени от начала реакции (1, 2, 3, 4, 5 мин.).
6. Рассчитайте активность каталазы по формуле:

где A – активность каталазы, см³/г•мин.; m – масса навески ткани, г; t – время, мин. Найдите среднее значение.

Оформление результатов

Результаты проведенного исследования оформите в виде таблицы.

Тема: ЛИПИДЫ

Липиды представляют собой неоднородную группу химических соединений, нерастворимых в воде, но хорошо растворимых в неполярных органических растворителях: хлороформе, эфире, ацетоне, бензоле и др., т.е. общим их свойством является гидрофобность (гидро – вода, фобия – боязнь). Из–за большого разнообразия липидов дать более точное определение им невозможно. Подразделяют липиды на простые (содержат только остатки жирных кислот, спиртов (альдегидов) и сложные (содержат остатки также фосфорной, фосфоновой кислот, моно– и олигосахаридов). Липиды в большинстве случаев являются сложными эфирами жирных кислот и какого–либо спирта. Выделяют следующие классы липидов: триацилглицерины, или жиры, фосфолипиды, гликолипиды, стероиды, воска, терпены. Различают две категории липидов – омыляемые и неомыляемые. К омыляемым относятся вещества, содержащие сложноэфирную связь (воска, триацилглицерины, фосфолипиды и др.). К неомыляемым относятся стероиды, терпены.

Триацилглицерины являются сложными эфирами трехатомного спирта глицерина:

Фосфолипиды содержат гидрофобную и гидрофильную области и поэтому обладают амфифильнымы свойствами, т.е. они способны растворяться в неполярных растворителях и образовывать стойкие эмульсии с водой.

Фосфолипиды в зависимости от наличия в их составе спиртов глицерина и сфингозина делятся на глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды.

Формулу глицерофосфолипидов можно представить так:

где Х – остаток НО–содержащей полярной молекулы (полярная группировка).

Сфингофосфолипиды по составу сходны с глицерофосфолипидами, но вместо глицерина содержат аминоспирт сфингозин.

Наиболее распространенными сфингофосфолипидами являются сфингомиелины. Они образованы сфингозином, холином, жирной кислотой и фосфорной кислотой:

Гликолипиды содержат в своем составе углеводный компонент. К ним относятся гликосфинголипиды, содержащие, кроме углевода спирт, сфингозин и остаток жирной кислоты:

Стероиды являются производными циклопентанпергидрофенантрена. Один из важнейших представителей стероидов – холестерин. В организме он встречается как в свободном состоянии, так и в связанном, образуя сложные эфиры с жирными кислотами.

Воска – это сложные эфиры, образованные длинноцепочечными жирными кислотами (число атомов углерода 14 – 36) и длинноцепочечными одноатомными спиртами (число атомов углерода 16 – 22). В качестве примера рассмотрим формулу воска, образованного олеиновым спиртом и олеиновой кислотой:

В основе терпеновых соединений лежат изопреновые остатки:

К терпенам относятся эфирные масла, смоляные кислоты, каучук, каротины, витамин А, сквален. В качестве примера приведем формулу сквалена:

Сквален является основным компонентом секрета сальных желез.

Лабораторная работа №1

Физико–химические свойства жиров

Реактивы и материалы: растительное масло; твердый жир; яблоко; картофель; гексан (бензин); этиловый спирт; ацетон; 2 %–й раствор карбоната натрия; 2 %–й раствор мыла; дистиллированная вода.

Оборудование: пробирки; водяная баня; фильтровальная бумага.

Ход работы

Задание 1. Образование масляного пятна.

1. Каплю растительного масла нанесите на кусочек бумаги. Образуется пятно.
2. Кусочек свиного сала, яблока, картофеля раздавите на кусочке бумаги с образованием пятна.
3. Нагрейте бумагу с пятнами на слабо нагретой плитке. Пятно, образованное жиром, не исчезает при нагревании.

Задание 2. Растворимость жиров.

1. Поставьте два ряда пробирок по 4 в каждом.
2. В пробирки первого ряда внесите по 3 капли растительного масла, в пробирки второго ряда – по кусочку твердого жира.
3. В первую пробирку каждого ряда прилейте 2 см³ дистиллированной воды, во вторую – столько же гексана или бензина; в третью – ацетона и в четвертую – спирта.
4. Все пробирки взболтайте и наблюдайте за растворимостью жиров в различных растворителях. Пробирки со спиртом рекомендуется нагреть на водяной бане.

Задание 3. Эмульгирование жирных масел.

1. В три пробирки внесите по 5 капель растительного масла.
2. В первую пробирку добавьте 2 см³ дистиллированной воды, во вторую – 2 см³ 2 %–го раствора карбоната натрия, в третью – столько же 2 %–го раствора мыла.
3. Содержимое пробирок сильно взболтайте. В первой пробирке образуется неустойчивая эмульсия масла в воде, в остальных – устойчивая эмульсия благодаря действию эмульгаторов, которые, адсорбируясь на поверхности жировых капель, придают им одинаковый заряд и снижают поверхностное натяжение.

Оформление результатов

Оформите результаты проведенных исследований в виде таблицы.

Лабораторная работа №2

Получение мыла и изучение его свойств

При взаимодействии жиров со щелочами происходит их гидролиз с образованием солей высших жирных кислот (мыла) и глицерина. Натриевые соли представляют собой твердые мыла, калиевые – жидкие. Реакция идет согласно уравнению

Реактивы: растительное масло или животный жир; 30 %–й спиртовой раствор гидроксида калия; 15 %–й раствор соляной кислоты; 10 %–й раствор хлорида кальция; дистиллированная вода.

Оборудование: широкая пробирка с резиновой пробкой со вставленной в нее стеклянной трубкой; пробирки; водяная баня.

Ход работы

При выполнении данной работы необходимо соблюдать особую осторожность!

Задание 1. Омыление жира

1. В широкую пробирку внесите 1 см³ растительного масла или около 1 г животного жира и добавьте 10 см³ спиртового раствора гидроксида калия.

2. Пробирку закройте пробкой с воздушным холодильником и нагревайте на кипящей водяной бане в течение 25 – 30 мин. Эту часть работы необходимо проводить в вытяжном шкафу.

3. После нагревания в пробирку налейте 10 см³ горячей воды. Образуется гомогенный раствор калиевых солей жирных кислот (калиевого мыла). Данный препарат использовать для мытья рук, лица и других хозяйственных целей категорически запрещено!

Задание 2. Выделение свободных жирных кислот.

1. К 3 см³ полученного в первом задании раствора осторожно добавьте порциями 15 %–й раствор соляной кислоты до выделения свободных жирных кислот, которые всплывают на поверхность жидкости.

Задание 3. Образование нерастворимого мыла.

1. К 2 см³ раствора, полученного в задании 1, добавьте 1 см³ 10 %–го раствора хлорида кальция. Выпадают хлопья нерастворимого в воде осадка кальциевой соли высших карбоновых кислот.

Оформление результатов

Опишите ход выполнения работы. Приведите уравнения протекавших реакций.

Лабораторная работа №3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИСЛОТНОГО И ИОДНОГО ЧИСЕЛ ЖИРА

Цель работы: ознакомиться с методом определения кислотного и йодного чисел жира.

Принцип метода. Кислотностью жира или кислотным числом называется число миллиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в1 г жира.

Материалы и оборудование: спирт, нейтрализованный по фенолфталеину, раствор KOH (0,1 моль/л), 0,1 %-й раствор фенолфталеина, жир (подсолнечное масло).

Оборудование: колбы емкостью 50 мл, пипетки, бюретки, пробирки.

Ход работы

K 1 гжира добавляют 5 мл спирта, нейтрализованного по фенофталеину, тщательно перемешивают для максимального растворения свободных жирных кислот и титруют раствором KOH до появления не исчезающей после взбалтывания розовой окраски (окраска не должна исчезать в течение 0,5—1 мин).

Количество KOH, мг, или кислотное число (КЧ), которое необходимо для титрования свободных жирных кислот в1 гжира, равняется

КЧ=AfQ/a,

где A – объем раствора KOH (0,1 моль/л), израсходованного на титрование исследуемой пробы; а — навеска жира (г); f — коэффициент поправки на титрраствора KOH (0,1 моль/л); Q — количество KOH (5,61 мг) эквивалентное 1 мл раствора KOH (0,1 моль/л).

Принцип метода. Иодным числом называется количество граммов иода, которое прореагировало с100 г жира. Это число указывает на содержание в жире непредельных жирных кислот.

Определение иодного числа основывается на реакции присоединения иода по месту двойной связи, которая протекает по уравнению:

R–CH=CH–R+I₂+H₂O®R–CHI–CHOH–R+HI.

Реактивы: жир, спиртовый раствор иода (0,1 моль/л), 1 %–й раствор крахмала, раствор Na₂S₂O₃ (0,05 моль/л).

Оборудование: две конические колбы емкостью 50 мл, пипетки, бюретки.

Ход работы

B первую колбу помещают навеску жира 0,1 – 0,2 г(исследуемая проба), во вторую – 0,1–0,2 мл воды (контрольная проба), прибавляют по 10 мл спиртового раствора иода и перемешивают. Через 15 мин содержимое колб оттитровывают раствором Na₂S₂O₃ сначала до появления слабо–желтого окрашивания, а потом, прибавив 1 мл раствора крахмала, титруют до исчезновения синего окрашивания. Иодное число вычисляют по формуле:

ИЧ=(B–A)fQ100/(1000a),

где В – A – разность результатов титрования контрольного и опытного образцов в растворе гипосульфита (0,05 моль/л) (мл); а — навеска исследуемого жира (г);

f — коэффициент поправки на титр раствора Na₂S₂O₃ (0,05 моль/л);

Q — количество J₂ (12,69 мг), эквивалентное 1 мл раствора Na₂S₂O₃ (0,05 моль/л).

Лабораторная работа №4

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ЛИПИДОВ В ТКАНЯХ

Цель работы: ознакомиться с весовым методом определения общего содержания липидов в тканях.

Принцип метода. Липиды экстрагируют из тканей смесью Фолча, экстракт отмывают от нелипидных примесей солевым раствором. Количественное определение суммарных липидов проводят весовым методом.

Реактивы:

1. Хлороформ. 2. Метанол. 3. Смесь хлороформ – метанол в соотношении 2:1 по объему (смесь №1). 4. NaCl 0,73 % водный раствор (можно заменить 0,88 % KCl, 0,05 % CaCl₂). 5. Смесь растворителей, содержащая минеральные соли: хлороформ-метанол-водный раствор NaCl (0,58 %) или KCl (0,74 %) или СаС1₂ (0,04 %) в соотношении 3:48:47 (смесь №2).

Оборудование: пробирки, гомогенизатор, центрифуга, сушильный шкаф, аналитические весы.

Ход работы

Измельченную на холоде навеску ткани (200 – 250 мг мозга, 300 – 500 мг других тканей) помещают в гомогенизатор с тефлоновым или стеклянным пестиком, заливают 5 объемами смеси №1 и гомогенизируют в течение 5 мин. Экстракт отделяют от биомассы, сливают в мерный цилиндр. Процедуру повторяют еще 2 – 3 раза. Измельченную ткань вместе с экстрактом количественно переносят в мерный цилиндр (конечное разведение ткани 1:20), перемешивают и через 20 мин фильтруют через обезжиренный фильтр или центрифугируют при 1000 gв течение 15 – 20 мин K центрифугату добавляют 0,73 %–й водный раствор хлорида натрия в объеме, составляющем 20 % от объема экстракта липидов. Экстракт перемешивают и центрифугируют при 600 g в течение 15 – 20 мин. После центрифугирования система разделяется на две фазы. Верхнюю фазу осторожно декантируют с помощью шприца и пипетки с оттянутым концом, отбрасывают. Поверхность нижней фазы и внутренние стенки центрифужной пробирки ополаскивают 3 мл смеси №2, тщательно следя за тем, чтобы не было перемешивания нижней фазы и промывной смеси. Последнюю отбрасывают и промывание повторяют еще 2 раза. После удаления промывной смеси к нижней фазе, т.е. к хлороформному раствору липидов, прибавляют по каплям метанол до образования однофазной системы, раствор перемешивают.

Количество липидов определяют весовым методом. Для этого круглодонную колбу для роторного испарителя доводят до постоянного веса, помещают в нее экстракт липидов, содержащий не менее 10 – 20 мг липидов, растворитель упаривают на роторном испарителе. Колбу с осадком липидов доводят до постоянного веса в вакуумэксикаторе над KOH. Путем повторного взвешивания определяют вес осадка липидов и рассчитывают содержание липидов в тканях в процентах с учетом взятой навески. Взвешивание проводят на аналитических весах.

Лабораторная работа №5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩИХ ФОСФОЛИПИДОВ В ТКАНЯХ

Цель работы: ознакомиться с фотометрическим методом определения содержания общих фосфолипидов в тканях.

Принцип метода. Метод основан на определении неорганического фосфора, образованного при кислотном гидролизе фосфолипидов. Содержание фосфора определяют по образованию комплекса с молибдатом аммония и его восстановлению аскорбатом до появления интенсивно синего цвета с максимумом светопоглощения 750 нм.

Реактивы: молибдат аммония 2 % раствор; аскорбиновая кислота 2 % раствор; 20 % ТХУ; 40 % КОН, приборы и реактивы.

Оборудование: пробирки, кюветы, спектрофотометр, гомогенизатор, центрифуга с охлаждением.

Ход работы

К 0,5 мл раствора липидов в хлороформе прибавить 1 мл концентрированной хлорной кислоты и сжигать при температуре около 180 °C. После охлаждения объем довести водой до 2 мл, отобрать 0,2 мл и добавить 1,8 мл воды, a затем 0,2 мл 10% аскорбата, 2 мл 1 % молибдата аммония. После 20-минутной инкубации в 45 °C, измерить оптическую плотность при 750 нм. Аналогично поступить с пробой стандартного раствора фосфата и с пробой на чистоту реактивов (Кейтс, 1975).

Что делает отдел по эксплуатации и сопровождению ИС? Отвечает за сохранность данных (расписания копирования, копирование и пр.)...

Что вызывает тренды на фондовых и товарных рынках Объяснение теории грузового поезда Первые 17 лет моих рыночных исследований сводились к попыткам вычис­лить, когда этот...

ЧТО ТАКОЕ УВЕРЕННОЕ ПОВЕДЕНИЕ В МЕЖЛИЧНОСТНЫХ ОТНОШЕНИЯХ? Исторически существует три основных модели различий, существующих между...

Что способствует осуществлению желаний? Стопроцентная, непоколебимая уверенность в своем...

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: