Этап 4 — восстановление или повреждение
Этап 4 в развитии токсичности обусловлен неадекватным восстановлением поврежденных
структур (см. рис. 3-3). Многие токсиканты повреждают макромолекулы, что увеличивает мас-
штаб альтерации и способствует развитию токсического эффекта.
Поврежденные молекулы могут быть восстановлены различными способами, например окис-
ление тиоловых белков или метилирование ДНК могут быть полностью устранены (см. гл. 3.3).
После химического повреждения ДНК и перекисного окисления жиров клетка гидролитически
удаляет поврежденную часть. В некоторых случаях поврежденная молекула полностью дегра-
дирует и необходим повторный синтез.
Восстановление белков. Тиольные группы необходимы для выполнения функций некоторых
белков (см. гл. 8.5). Окисленные группы восстанавливаются энзиматически при каталитичес-
ком участии тиоредоксика и глутаредоксина. Восстановление также может происходить при
участии НАДФН. Восстановление окисленного гемоглобина осуществляется путем передачи
электронов с цитохрома Ь5, последний регенерируется при участии НАДН-зависимой цитохром
Ь5-редуктазы. Молекулы шаперонов (например, белки теплового шока) активно синтезируются
в ответ на денатурацию белков. Они восстанавливают структуру поврежденных белков. По-
следние также уничтожаются протеолизом. АТФ/убихинонзависимые протеолитические сис-
темы контролируют уровень регуляторных белков (например, р53, IkB, циклинов), которые
элиминируют поврежденные внутриклеточные белки.
Восстановление жиров. Окисленные жиры восстанавливаются в ходе сложного процесса,
включающего ферменты класса редуктаз, глутатионпероксидазу и глутатионредуктазу. Для ре-
генерации редуктаз необходим НАДФН.
Восстановление ДНК. Благодаря высокой плотности упаковки и наличию механизмов ре-
парации ядерная ДНК довольно устойчива к действию свободных радикалов и электрофилов.
Гидролиз клеточных белков (например, PARP, DFF,
а-фодрина, актина, FAK, SERBP, ламинов)
АПОПТОЗ
Рис. 3-11. Пути апоптоза, инициированные разрушением митохондрий, повреждением ДНК и стиму-
ляцией Fas- или TNF (первого типа)-рецепторов. DFF — фактор фрагментации ДНК; FAK — киназа
локальной адгезии; PARP — поли-АДФ-рибозополимераза; SERBP — стерольный регулятор связывания
белков, TNFa — фактор некроза опухолей (по Cregus Z., Klaassen С, 2003).
Митохондриальная ДНК не имеет достаточно эффективных механизмов репарации и потому
более уязвима.
Участки ковалентных сшивок цепей ДНК репарируются ферментами, например ДНК-фото-
лиазой, которая вырезает сшитые УФ-излучением пиримидиновые основания. Этот хромофор-
содержаший фермент функционирует только при освещении. Метильные группы, присоеди-
ненные к Об-атому гуанина, удаляются 06-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазой (см. гл. 3.3),
происходит полное восстановление структуры.
Удаление участка ДНК состоит из двух процессов — удаления поврежденных оснований и
нуклеозидов. Незначительные дефекты (не нарушающие спиральную структуру) опознаются
и устраняются относительно специфичной ДНК-гликозилазой (гидролизует N-гликозидные
связи и образует беспуриновые и беспиримидиновые участки). Эти участки распознаются эн-
донуклеазой, которая гидролизует фосфорно-эфирные связи. После удаления поврежденного
участка структура восстанавливается ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой. Крупные участки уда-
ляются АТФ-зависимой нуклеазой. Этот фермент распознает искаженные участки и вырезает
его вместе с частью неповрежденных нуклеотидов (с обеих сторон от поврежденного участка).
Вырезанный участок ДНК восстанавливается путем вставок нуклеотидов ДНК-полимеразами
и лигазами. Вторая нить используется как шаблон.
PARP, вероятно, является важным инструментом репарации. Этот фермент присоединяется
и активируется поврежденными участками ДНК. Активная PARP гидролизует НАД+ и исполь-
зует освободившуюся АДФ-рибозу для формирования на ядерных белках цепей поли-АДФ-
рибозы. Так как АДФ-рибоза заряжена отрицательно, то получающаяся цепь также заряжается
отрицательно. Цепи ДНК содержат много анионных частиц. Одноименный заряд приводит к
расхождению цепей ДНК и молекул ядерных белков, происходит деконденсация хроматиновой
структуры. Этот процесс необходим, потому что репарации подлежат только освобожденные от
белков и частично раскрученные цепи ДНК.
Рекомбинационное (пострепликационное) восстановление. Данный механизм срабатывает,
если реплицируется поврежденная ДНК. Это предотвращает синтез дефектных нитей ДНК. Ре-
зультатом репликации являются две двухцепочечные цепи ДНК: одна из них содержит длинный
пострепликационный участок во вновь синтезированной цепи, другая идентична материнской
ДНК. Последняя путем обмена участками (кроссовером) восстанавливает поврежденную цепь
другой ДНК. Такой механизм обычно встречается при сшивках цепей ДНК.
Восстановление клеток: периферические нейроны. Восстановление нейронов — крайне мед-
ленный процесс. Зрелые нейроны потеряли способность к делению, поэтому не происходит
замещения поврежденных клеток здоровыми. Восстановление повреждений аксонов в перифе-
рических нейронах происходит с участием макрофагов и шванновских клеток, формирующих
миелин. Макрофаги удаляют поврежденный участок, выделяют цитокины и факторы роста,
активирующие шванновские клетки, на поверхности которых локализуется белок Раг-3 в мо-
мент контакта с подлежащим миелинизации аксоном. Полярный белок Раг-3 регулирует, как
было установлено в 2005 г., процесс миелинизации. Клетки Шванна пролиферируют и запус-
кают процесс восстановления нейронов. Дифференцированная клетка Шванна образует канал,
по которому происходит рост аксона, кроме того, она выделяет факторы роста.
В центральной нервной системе млекопитающих избыточное удлинение аксонов предот-
вращается ингибиторными гликопротеинами и хондроитинсульфатпротеогликанами, которые
выделяются олигодендроцитами и астроцитами. Повреждение нейронов центральной нервной
системы необратимо, но восстановление функции возможно за счет других нейронов.
Восстановление тканей. В тканях, способных к регенерации, дефекты устраняются некрозом
или апоптозом и пролиферацией.
Апоптоз является механизмом активного удаления поврежденных клеток и способом вос-
становления структуры ткани. Клеточные органеллы уплотняются и превращаются в апопто-
тические тельца, которые фагоцитируются. Воспалительный процесс не развивается. Апоптоз
также может предотвращать появление новообразований, уничтожая клетки с опасными из-
менениями в структуре ДНК. Эффективное восстановление структуры тканей и органов при
апоптозе возможно только при замещении удаленных клеток новыми, т.е. в органах с высокой
пролиферативной активностью (костный мозг, дыхательный эпителий, эпителий желудочно-
кишечного тракта, эпидермис) или с относительно высокой активностью (клетки печеночной
и почечной паренхимы). Восстановления же других тканей (нейроны, кардиомиоциты, яйцек-
летки) не происходит в связи с потерей способности к делению.
Пролиферация: регенерация тканей. Ткани состоят из различных клеток и внеклеточного
матрикса. Прикрепление клеток друг к другу обеспечивают кадгерины — семейство трансмем-
бранных кальцийзависимых гликопротеинов, осуществляющих адгезивные межклеточные кон-
такты. Коннексины — нестабильные белки, живущие несколько часов, заполняют пространс-
тво между клетками. Интегрины — поверхностные гетеродимерные белки связывают клетки
с внеклеточным матриксом. Поэтому при восстановлении поврежденных тканей происходят
регенерация клеток и компонентов внеклеточного матрикса, а также реинтеграция новых кле-
ток в ткани и органы.
Замена клеток. Почти сразу после повреждения клеток соседние с ними клетки начина-
ют делиться. Покоящиеся клетки (фаза GO) переходят в фазу Gl. Начинается процесс мито-
за. В делящихся клетках происходит изменение экспрессии генов. Увеличивается экспрессия
предранних генов, кодирующих факторы транскрипции. Последние также активируют экс-
прессию некоторых генов. Через несколько часов экспрессируются поздние гены, кодирующие
белки-регуляторы клеточного цикла. Преобладающими процессами клетки становятся синтез
ДНК и митоз.
Регенеративный процесс запускается особыми веществами, выделяемыми поврежденными
клетками. Макрофаги, эндотелий чувствительны к этим сигналам и выделяют свои сигналь-
ные молекулы, инициирующие регенерацию. Фактор некроза опухолей а (ФНОа или TNFa) и
интерлейкин р (ИЛ-Р) способствуют активации покоящихся клеток, далее эти клетки под вли-
янием гепатоцит-ростового фактора (HGF) и трансформирующего ростового фактора альфа
(TGF-a) переходят к фазе митоза.
Кроме митоза, восстановление ткани возможно за счет миграции клеток. В слизистой обо-
лочке желудочно-кишечного тракта этот процесс происходит быстрее, чем рост новых клеток.
Восстановление слизистой оболочки управляется факторами роста и цитокинами.
Восстановление внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс состоит из белков, глико-
заминогликанов, гликопротеинов и протеогликанов. Активация покоящихся звездчатых клеток
происходит под влиянием тромбоцитарного ростового фактора (PDGF) и трансформирующего
ростового фактора бета (TGF-p), которые выделяются при разрушении тромбоцитов. Про-
лиферация звездчатых клеток вызывается сильным митогеном PDGF, в то время как TGF-
вызывает усиление синтеза звездчатыми клетками элементов внеклеточного матрикса (колла-
генов, фибронектина, тенасцина, протеогликанов).
Побочные реакции при повреждении тканей. Макрофаги и эндотелиоциты выделяют большое
количество веществ, среди которых БОФ, приводящие к развитию воспаления и лихорадки. В от-
вет на повреждение тканей макрофаги выделяют цитокины (ФНОа, ИЛ-1), нарушающие процес-
сы микроциркуляции и способствующие развитию воспаления. Цитокины стимулируют ближай-
шие стромальные клетки (эндотелиоциты, фибробласты), которые начинают выделять медиаторы,
расслабляющие микрокапилляры и вызывающие увеличение проницаемости сосудистой стенки.
Активированные эндотелиоциты облегчают переход лейкоцитов в поврежденные ткани (под дейс-
твием хемоаттрактантов и молекул клеточной адгезии). Адгезия лейкоцитов к эндотелиальным
клеткам обеспечивается внутриклеточными молекулами адгезии (ICAM-1). После фазы адгезии
происходит выход лейкоцитов через сосудистую стенку в ткани. Он облегчается разностью кон-
центраций хемоаттрактантов, усиливающих синтез в лейкоцитах интегринов. Хемоаттрактантами
являются хемотаксические цитокины (хемокины) — производные липидов, например тромбоцит-
активирующий фактор (PAF) и лейкотриен В4 (LTB4). Клетка любого типа, находящаяся вблизи
места повреждения, выделяет ICAM-1, которые вызывают выход лейкоцитов в ткани. Лейкоциты
синтезируют медиаторы, способствующие развитию воспалительного процесса.
В процессе воспаления генерируются активные формы кислорода и азота. В поврежденных
тканях макрофаги инициируют процесс, называемый кислородным взрывом. Это выделение
большого количества свободных радикалов и активных ферментов. Мембранная НАДФН-ок-
сидаза после активации макрофагами и/или гранулоцитами также продуцирует свободные ра-
дикалы, например супероксид-анион-радикал, который затем превращается в гидроксид-ради-
кал. Цитотоксичный свободный радикал — N0' — макрофаги синтезируют путем окисления
аргинина синтазой-NO. Далее радикалы реагируют друг с другом (см. рис. 3-5) и образуют дру-
гие свободные радикалы — N02' и COj. Гранулоциты выделяют во внеклеточное пространство
миелопероксидазу, катализирующую образование Н0С1 из пероксида водорода и хлорид-иона.
НОС1 при взаимодействии с Fe2+ или 02 образует гидроксид-радикал. Все свободные радикалы
усиливают воспаление, одновременно препятствуя микробному заражению.
Синтез альтерирующих (повреждающих) белков: белки острой фазы. Цитокины макрофагов
и эндотелиоцитов — ИЛ-6, ИЛ-1, ФНОа, действуя на мембранные рецепторы, усиливают экс-
прессию генов, кодирующих БОФ (положительные и отрицательные).
Положительные БОФ способствуют уменьшению повреждения тканей и запускают про-
цессы регенерации. Одним из способов их действия является ингибирование лизосомальных
ферментов.
Отрицательными БОФ являются альбумин, транстиретин, трансферрин, некоторые формы
цитохрома Р450 и глутатион-Б-трансферазы. Эти белки играют важную роль в детоксикации,
а иногда и усилении токсичности ксенобиотиков, поэтому они влияют на концентрацию и
определяют место накопления химических агентов в острую фазу.
Генерализованные реакции. Цитокины активированных макрофагов и эндотелиоцитов из-
меняют нейрогормональный статус. ИЛ -1, ФНОа и ИЛ-6 действуют на температурный центр
в гипоталамусе. Одновременно ИЛ -1 и ИЛ-6 усиливают продукцию АКТГ, стимулирующего
выход кортизола из надпочечников. Обеспечивается и обратная связь — кортизол ингибирует
синтез цитокинов.
Системы восстановления иногда не способны выявить повреждение. Регенерации не будет,
если повреждаются кофакторы и ферменты системы восстановления, а также при ковалентном
связывании ксенобиотиков с белками.
Возможен случай, когда системы восстановления усиливают токсический эффект, напри-
мер истощение запасов НАД+ под действием PARP при восстановлении ДНК, расходование
НАДФН на восстановление окисленных белков. Из-за истощения запасов доноров электронов
под угрозу ставится процесс синтеза АТФ. При неконтролируемой пролиферации также воз-
можно усиление токсического эффекта, что может привести к новообразованиям и фиброзу.
Токсичность — следствие отсутствия регенерации. Отсутствие или неэффективность процес-
сов регенерации может встречаться на всех уровнях (молекулярном, клеточном, тканевом).
Некроз тканей. Повреждение клеток заканчивается клеточной смертью при неэффектив-
ности процессов восстановления или необратимости повреждений. Развитие некроза могут
остановить два механизма: апоптоз и пролиферация. Апоптоз предотвращает воспаление. Про-
лиферация запускается вскоре после повреждения ткани. Этот процесс способствует восста-
новлению структуры и функций ткани. Чувствительность тканей к повреждающим факторам
и способность к восстановлению изменяются во времени и определяют выживание клеток.
Эффективность репарации также зависит от концентрации токсиканта, но не только потому,
что токсикант вызывает сильное повреждение клеток, но и из-за нарушения самих механизмов
восстановления. Некроз происходит при неэффективности механизмов восстановления кле-
ток, отсутствии апоптоза и митоза.
Фиброз — патологический процесс, характеризующийся чрезмерным образованием межкле-
точного матрикса ненормального состава. Как уже было сказано, повреждение клеток запускает
процессы пролиферации и ресинтеза компонентов межклеточного матрикса. Если последний
процесс по каким-то причинам не останавливается, то развивается фиброз. Главным факторов
фиброгенеза является TGF-p. Повышенное образование этого вещества в острую фазу — нор-
мальный ответ на повреждение тканей. Его синтез прекращается по завершении процессов ре-
генерации. Фиброзная активность TGF-p обусловлена стимуляцией синтеза и ингибированием
деградации компонентов межклеточного матрикса. В процессе фиброза происходит изменение
состава межклеточного матрикса. Непропорционально увеличено количество коллагенов и ла-
минина — адгезивного гликопротеина, полипептидные цепи которого ассоциированы в форме
асимметричного креста и удерживаются вместе дисульфидными связями.
Канцерогенез. Химические канцерогены нарушают процессы репарации ДНК, апоптоза и
терминации клеточной пролиферации.
Повреждение репарации ДНК: мутации. Химические и физические факторы могут вызы-
вать неопластическую трансформацию клеток генотоксическими и негенотоксическими меха-
низмами. Химические агенты, действующие на ДНК, вызывают образование аддуктов, оксиле-
ние, сшивки цепей. Если эти повреждения не устраняются, появляются мутации и новые цепи
ДНК уже будут отличаться от материнских. Наиболее неблагоприятная ситуация — экспрессия
поврежденными генами белков-регуляторов клеточного деления. Такие клетки способны к
сверхнормальному росту и вытесняют здоровые структуры. Результатом является образование
опухоли.
Мутации в протоонкогенах. Протоонкогены — гены, кодирующие белки-регуляторы кле-
точного цикла. Они включают факторы роста, рецепторы к факторам роста, внутриклеточные
системы передачи сигнала (G-белки, протеинкиназы, циклины, циклинзависимые протеинки-
назы) и факторы транскрипции. Периодическое увеличение экспрессии этих генов необходимо
для обеспечения клеточного цикла. Постоянное усиление активности протоонкогенов вызыва-
ет неоплазию. Генотоксический механизм — изменение структуры протоонкогенов. Повреж-
денный ген (онкоген) запускает процесс усиленного синтеза белков-регуляторов. Примером
мутационной активации онкогенных белков могут служить Ras-белки. Они расположены на
внутренней поверхности клеточной мембраны и в их функции входит синтез трансмиттеров в
ответ на действие рецепторов факторов роста (см. рис. 3-9). Ras — молекулярный «переключа-
тель», активный в ГТФ-форме и неактивный в ГДФ-форме. Некоторые мутации кодирующего
его гена приводят к снижению активности ГТФазы. Белок более продолжительное время ос-
тается в форме ГТФ. Постоянный синтез медиаторов приводит к неконтролируемой пролифе-
рации и трансформации.
Мутации в опухольподавляющих генах. Эти гены кодируют белки, замедляющие все фазы
клеточного цикла, — ингибиторы циклинзависимых протеинкиназ, факторов транскрипции.
Ген р53 кодирует белок массой 53 ООО Д. Он активирует экспрессию генов, кодирующих вещес-
тва-ингибиторы клеточного цикла. Одновременно он провоцирует апоптоз (блокада антиапоп-
тотических факторов и активация проапоптотических). Повреждение ДНК и неисправимые
мутации стабилизируют белок р53. Происходит его накопление, замедляется клеточный цикл,
облегчается репарация или запускается апоптоз.
Взаимодействие протоонкогенов и опухольподавляющих генов в процессе канцерогенеза.
Накопление мутаций протоонкогенов и опухольподавляющих генов — основной механизм
злокачественной трансформации клеток. Так как жизнь клеток регулируется равновесием ми-
тоза и апоптоза, то любые изменения в генетической программе могут привести к смещению
этого равновесия. Облегчение процессов апоптоза препятствует развитию опухоли и наоборот.
Усиленная митотическая активность провоцирует канцерогенез по трем причинам.
• Увеличивается вероятность мутаций. При сокращении длительности фаз клеточного цикла
уменьшается время, достаточное для репарации.
• Избыточный синтез протоонкогенных белков увеличивает вероятность их связывания с
онкогенными белками, облегчая тем самым неопластическую трансформацию. Клетка на
ранних этапах развития опухоли в период многоклональной гиперплазии под воздействием
неких генетических или других факторов приобретает повышенную активность метилтранс-
феразы, что при дальнейшем развитии клонов в опухоли выражается в гиперметилирова-
нии. Это приводит к транскрипционной инактивации и генетической нестабильности силь-
но метилированных участков ДНК. Данные изменения закрепляются и развиваются при
дальнейшей профессии опухоли. Следующие последовательные события разбалансировки
метилирования приводят к подавлению транскрипции генов или потере их функций через
разрушение целостности хромосом, их повреждение и потерю аллелей.
• Клеточные взаимодействия в процессе пролиферации временно прекращаются. Это приво-
дит к инвазивному росту опухолевых клеток.
Заключение
• Взаимодействие токсиканта с эндогенными молекулами-мишенями может вызвать наруше-
ния функции клеток и/или структур или запустить механизмы восстановления на молеку-
лярном, клеточном и/или тканевом уровнях.
• Селективное связывание токсиканта с рецепторами одного типа характерно для небольшого
числа высокотоксичных агентов (например, некоторые фосфорорганические соединения,
ботулотоксин, аманитин).
• Чаще токсикант имеет сродство к нескольким рецепторам, взаимодействие с которыми и
приводит к формированию определенного биологического эффекта.
• Биотрансформация, приводящая к образованию токсичных веществ, называется токсикаци-
ей или метаболической активацией.
• Биотрансформация, приводящая к элиминации токсиканта или предотвращение его обра-
зования in vivo, называется детоксикацией.
• Апоптоз, или запрограммированная клеточная смерть, — жестко контролируемый, процесс
фрагментации и фагоцитоза клеток макрофагами (в основном) без развития воспалительной
реакции.
• Повышенное содержание внутриклеточного кальция опасно, оно может приводить к ис-
тощению энергетических запасов (ингибирование АТФазы, участвующей в окислительном
фосфорилировании), дисфункции микрофиламентов, активации гидролитических фермен-
тов и генерации активных форм кислорода и азота.
• Повреждение клетки ведет к ее некрозу, если молекулярные механизмы восстановления
неэффективны или молекулярное повреждение необратимо.
• Химический карценогенез включает в себя недостаточность функций различных репаратив-
ных механизмов (сбой репарации ДНК, нарушение регуляции апоптоза и сбой процессов
завершения пролиферации).
3.3. ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ТОКСИКОЛОГИЕЙ И ГЕНОМИКОЙ.
ГЕННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ. МЕТАБОЛОМИКА И МЕТАБОНОМИКА
Плоть человека — свиток, на котором
отмечены все даты бытия.
Максимилиан Волошин
Природа проста и не роскошествует
излишними причинами.
И. Ньютон
Модификация генетического материала человека химическими или физическими агентами
(например, радиацией) представляет одно из наиболее серьезных последствий их воздействия.
Однако число агентов или процессов, которые известны как приводящие к таким изменениям,
достаточно ограничено.
Генетическая токсикология оценивает результаты воздействия различных факторов как на
ДНК, так и на генетические процессы в живых клетках и организмах. Под генотоксичностью
следует понимать способность химических, физических и биологических факторов оказывать
повреждающее действие на генетические структуры организма. Малая часть последовательнос-
ти ДНК копируется в протеинкодируемую РНК. Кодируемая последовательность основных
пар называется экзон, некодируемая последовательность основных пар — интрон. Большинс-
тво токсикантов оказывают неблагоприятное воздействие, прямым или косвенным путем на-
рушающее нормальные процессы передачи сигналов в клетке. Считается, что ксенобиотики
инициируют последовательность событий, которые начинаются с рецептора, сдерживающего/
активизирующего генную и протеиновую экспрессию. Экспрессия гена — активизация транс-
крипции гена, в процессе которой на смысловой нити ДНК синтезируется мРНК. Поскольку
мРНК — предшественники ферментов, измерение их относительного содержания в образцах
ткани или клеток, подверженных действию токсиканта, показывает потенциальное вовлечение
генов в этиологию токсичности. Это не новая мысль, однако, согласно гипотезе, основан-
ной на многочисленных исследованиях и наблюдениях, полагают, что механизмы стрессовых
факторов предшествуют возможному повреждению генов. Потенциальные мутагены можно
разделить на физические, биологические химические агенты. Многие характеристики инду-
цированной излучением мутации считаются схожими с таковыми химически индуцированной
мутации. Исследователи выявили химические мутагены в 10 классах соединений, включая аро-
матические циклы, эфиры, галогенированные алифатические и ароматические углеводороды,
нитрозамины, некоторые пестициды, эфиры фталевой кислоты, некоторые фенолы, некоторые
полихлорированные дифенилы и ароматические полициклы. Первые работы в области хими-
ческого мутагенеза относятся к началу 30-х годов XX века, когда была открыта мутагенная
активность йода и аммиака (В.В. Сахаров и М.Е. Лобашев), алкалоида колхицина (A. Dustin).
В 1946 г. независимо друг от друга И.А. Рапопорт и Ш. Ауэрбах сообщили о способности фор-
мальдегида и иприта индуцировать частоту мутаций, сопоставимую по величине с действием
ионизирующей радиации. Введение в исследовательскую и аналитическую работу микронабора
ДНК, способного измерять уровень экспрессии в тысячах генов одновременно (1990), принес-
ло новую революционную информацию. Как микроанализ ДНК может помочь токсикологии?
 Образец экспрессии генов является уникальным
по выявлению конкретных типов повреждений по
сравнению с установлением или измерением еди-
ничного фермента или метаболита (схема 3-3), так
как содержание метаболитов и активность фер-
ментов могут быть изменены под влиянием мно-
гих факторов (см. гл. 4).
Измерение генной экспрессии направлено на
увеличение чувствительности и специфичности
диагностических исследований (рис. 3-12).
Однако повышение чувствительности теста не
должно навредить пациенту. Так, некоторые из-
менения в экспрессии генов не означают проявле-
ния неблагоприятных эффектов. Ответственность
за оценку генной экспрессии лежит на ученом,
который должен учитывать другие дополнитель-
ные данные для получения наиболее адекватно-
из исследований. Для однозначной
го вывода
оценки повреждений органов при клинических
испытаниях новых лекарственных средств нередко возникает необходимость в применении
альтернативных методик. Например, высокая активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и
аспартатаминотрансферазы (ACT) считается признаком гепатоцеллюлярного повреждения.
АЛТ преимущественно находится в клетках печени, поэтому изменение ее активности более
специфично для заболеваний печени, ACT присутствует в сердце, скелетных мышцах, мозге,
почках, печени, а уровень активности и АЛТ, и ACT, как известно, повышается при инфар-
кте миокарда, сердечных нарушениях, мышечных заболеваниях, заболеваниях центральной
нервной системы и других расстройствах. Количественная оценка имеет малую прогности-
ческую ценность и не всегда соответствует степени повреждения печени (см. гл. 2.4.2). При
детектировании токсических эффектов эти маркеры неспецифичны и могут изменяться под
действием других факторов, не относящихся к повреждению печени. Результаты генетических
исследований являются наиболее чувствительными и специфичными диагностическими и про-
гностическими тестами.
Механизм токсичности ряда ксенобиотиков неизвестен. Высокоспецифичные изменения
экспрессии генов помогают установить механизм токсичности химического агента, например,
последовательность передачи сигнала (см.выше) или причины ингибирования ферментных
систем (см. гл. 4), что в дальнейшем даст возможность определить эффективные биомаркеры,
предупредить лекарственные взаимодействия, предвидеть побочные эффекты (см. гл. I и 4).
Соотношение экспрессии генов и фенотипа
Совокупность параметров экспрессии генов часто говорит о состоянии соответствующего
органа. Фенотип может быть определен с помощью клинических исследований, функциональ-
ных тестов, измерения компонентов сыворотки крови и гистологической оценки. Связывание
генной экспрессии с подобными изменениями — ключ к поиску биомаркеров токсических
эффектов и формирование возможной гипотезы относительно механизма действия токсиканта.
Прежде чем пытаться установить соотношение изменений экспрессии генов и фенотипа, необ-
ходимо разобраться в физиологии органов (см. гл. 2). Например, почка — это частая мишень
для токсикантов окружающей среды и определенных классов лекарственных соединений. Вос-
приимчивость почки к повреждению связана с ее уникальным анатомическим строением и фи-
зиологическими функциями. Клетки проксимального канальца реабсорбируют большинство
ионов воды (Na+, Са 2+, К+, О", НС03", Р043") и различных метаболитов. В табл. 3-3 приведены
примеры веществ, проявляющих токсическое действие на почку (подробнее, см. гл. 2).
Представленные токсиканты имеют различную химическую природу. По-видимому, за про-
явление почечной токсичности отвечает не только структурная особенность молекулы ксе-
нобиотика. Для оценки изменений генной экспрессии, которые происходят под влиянием
классических почечных токсикантов, были проведены токсикогенетические исследования. Из-
вестно, что мишенью цисплатина — цис-дихлородиамин платины (II)—(CIS) и охратоксина А
(ОТА) является сегмент проксимального канальца S3. CIS токсичен для представителей всех
биологических видов и без ферментативной активации преобразовывается в предельно токсич-
ную форму. CIS имеет изомерную транс-конфигурацию, которая называется «трансплатин» и
не является токсичной. Токсичность CIS может выявляться несколькими способами, включа-
ющими измерение креатинина плазмы, мочевины крови и т.д.
ОТА — токсин, выделенный из особых видов грибов, включающих Aspergillus ochraeus и
Penicillium verrucosum, которые присутствуют во множестве различных продуктов и напитков,
таких как зерновые, орехи, специи, кофе и красное вино (см. гл. 11). Подобно CIS, ОТА вызы-
вает повреждение проксимального канальца почки в сегменте S3. Проводили независимые ис-
следования генной экспрессии в почке, на которую воздействовали токсическими дозами CIS
и ОТА. При этом наблюдали почти одинаковые гистопатологические изменения, включающие
некроз S3-KneTOK проксимального канальца и рассеянный апоптоз. Оба соединения накапли-
вались в определенной области проксимального канальца. В этих исследованиях гистологичес-
кая оценка явилась отправной точкой проверки взаимосвязи параметров генной экспрессии и
морфологических повреждений. Анализировали гены крыс, которым вводили CIS, и крыс, ко-
торым вводили ОТА. Несмотря на то что только 250 генов были включены в исследование, уда-
лось обнаружить несколько функциональных классов генов, которые ответственны за клеточ-
ный транспорт, повреждение ДНК и метаболизм. Из-за того что клетка должным образом не
выполняет своих обычных функций для предотвращения критических процессов, изменяется
экспрессия генов. Острая фаза генного ответа наступает при возникновении соответствующего
количества различных клеточных нагрузок. Таким образом, структурно и фармакологически
разные соединения, делящие одни и те же токсикологические конечные точки, имеют сходство
в экспрессии генов. Такие гены могут быть удовлетворительными биомаркерами. Кандидаты
в биомаркеры должны соответствовать многим требованиям, включая возможность раннего
детектирования, чувствительность и специфичность анализа. При этом гены, чьи протеиновые
продукты секретируются в кровяное русло, являются лучшими кандидатами, по сравнению с
другими биомаркерами. В настоящее время для обнаружения токсикантов ведущие лабора-
тории мира активно проводят поиск и выбор биомаркеров по описанной выше схеме. Высо-
коточные технологии определения экспрессии генов позволяют находить характерные черты,
уникальные для специфичных токсикантов. Ожидается, что эта технология даст ответы на
приведенные ниже и многие другие вопросы. Насколько отличается метаболизм клетки раз-
личных тканей в результате чрезвычайно разных ответных реакций на введенный токсикант?
Различные биологические виды проявляют лишь частично совпадающие или индивидуальные
черты генного ответа на действие одного и того же токсиканта? Возможно ли использование
полученных данных для определения срока заболевания и оценки риска? Возможно ли исполь-
зовать изменения генной экспрессии как индикаторы ответных реакций на введение сложных
химических смесей? Поможет ли установить эта технология уникальность ответных реакций
организма на хроническое поступление низких доз токсикантов, которое характеризуется со-
вокупностью параметров генной экспрессии? Существует ли возможность обнаружения спе-
цифических характеристик генного полиморфизма, ответственных за повышенную склонность
к экологически обусловленным заболеваниям? В настоящее время совокупность параметров
генной экспрессии уже помогает в выборе генных мишеней. Безусловно, интерпретация из-
менений экспрессии генов возможна лишь в совокупности с данными клинической химии,
гистологических исследований и других параметров, определяющих фенотип.
Одна из самых сложных проблем генетической токсикологии связана с возможностью уве-
личения частоты мутаций в соматических и половых клетках человека в результате воздействия
химических веществ — генотоксикантов. Соматические мутации, как генные, так и хромосом-
ные, не передаются потомству человека, подвергшегося воздействию токсиканта, однако по-
вышение частоты этих мутаций может способствовать развитию приобретенных заболеваний,
в первую очередь рака.
К генотоксикантам относят:
• мутагены — агенты различного происхождения, вызывающие наследуемые изменения в ге-
номе;
• митогены — факторы или вещества, влияющие на процессы клеточного деления;
• анэугены — факторы, способствующие увеличению или уменьшению гаплоидного или
диплоидного числа хромосом на одну или более;
• кластогены — факторы, индуцирующие хромосомные разрывы;
• морфогены — факторы, вызывающие ненаследуемые генетические изменения (морфозы) на
уровне реализации признака в онтогенезе.
Мутация — внезапное изменение в наследственных структурах (ДНК, ген, хромосома, ге-
ном). Генетический материал организован в иерархию структурно-функциональных единиц —
от молекулярных сайтов внутри гена до целых хромосом и геномов. Соответственно существу-
ют разные типы мутаций — от генных до геномных.
Генная мутация — изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке
молекулы ДНК. Хромосомная мутация — любое нарушение структуры хромосом (делеция,
дупликация, инверсия, транслокация). Геномные мутации заключаются в изменении числа
хромосом в кариотипе. Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору хромосом,
называют полиплоидией. Отсутствие или избыточное количество отдельных хромосом объеди-
няют понятием «анэуплоидия», которую подразделяют на гиперплоидию (увеличение числа
хромосом) и гипоплоидию (потерю отдельных хромосом хромосомного набора). Геномные му-
тации возникают за счет повреждений в процессе мейоза, ведущих к нерасхождению хромосом
или хроматид по дочерним клеткам. Общая частота геномных и хромосомных мутаций в сома-
тических клетках человека составляет около 1%, а в зародышевых — около 0,5%.
Генные мутации, хромосомные отклонения (морфологические уродства) и анэуплодия —
факторы, участвующие в развитии рака. Многие мутагены и кластогены выступают в роли ини-
циаторов канцерогенеза. Однако мутагены, кластогены и анэугены также могут вызывать мно-
жестве
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:
|
